一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法，其中，所述单分子轴向定位装置包括光源系统、照明及调制系统、显微成像系统和信号控制处理系统。本发明专利技术的激发光分为两路从相对位置照射样品，在样品处产生轴向干涉同时对样品的荧光分子进行激发。通过照明图案的相位和光源强度快速切换，实现不同相位的图像同时采集，然后对单分子在不同照明图案下的亮度计算其相对于照明条纹的相位，再通过相位对位置进行解析，从而实现更高的轴向定位精度。利用该技术可以实现对单分子的轴向位置测量，相比以往的定位方法具有精度高且不受干涉长度的影响等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法
本专利技术属于荧光光信号测量
，尤其涉及一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法。
技术介绍
传统的光学显微镜由于光的衍射现象导致了分辨率极限的存在，一般为侧向200nm左右，轴向500nm左右。而近年来基于单分子定位的超分辨显微成像技术能够突破这种分辨率限制。这种成像技术依赖于对单个分子的荧光光信号的精确定位，而对单分子进行轴向定位的精度直接影响到三维成像的分辨能力。通常的轴向定位方式是在光路中加入柱面镜引入像散，或者进行双层面成像，通过单分子图像的形状判断轴向位置。这种定位方法通常精度远低于XY方向的定位精度，因此导致三维水平的分辨率较低。同时还有一种定位方法，使用两个显微物镜对样品同时成像，并将单分子荧光进行干涉，使用干涉测量的方式进行定位，这种方式能够极大地提高轴向定位精度，但是光路复杂，对稳定性要求很高，而且荧光的干涉距离很短，导致每次更换样品之后干涉的两条光路需要精细调节光程差。因此，解决上述问题对单分子定位和超分辨荧光荧光显微成像具有重要的意义和应用价值。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术公开了一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法，通过使用激发光干涉测量的方式进行单分子定位，用于解决现有技术中轴向定位精度低的问题，同时也可以解决使用干涉测量存在的干涉距离过短，光路需要不断调整的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置，包括：光源系统，其用于提供激发光；照明及调制系统，其与所述光源系统光路连接，所述照明及调制系统用于将激光分为两个光路并在样品处汇聚产生干涉图样，同时调制图样的相位；显微成像系统，其与所述照明及调制系统光路连接，所述显微成像系统用于收集样品产生的光信号并将收集的光信号汇聚到光电传感器的不同区域；信号控制处理系统；其分别与光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统连接，以对光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统进行同步有序控制。作为上述技术方案的进一步描述：所述光源系统包括激光器，在激光器的光路上依次设置有强度调制器和1/2波片，通过激光器发出的激光经过强度调制器控制光强，通过1/2波片控制偏振状态后进入到调制系统中。作为上述技术方案的进一步描述：所述强度调制器为声光调制器。作为上述技术方案的进一步描述：所述照明及调制系统包括电光调制器和偏振分光镜，由所述光源系统发出的激光经过所述电光调制器调制光束中两个偏振态之间的相位差，之后经过所述偏振分光镜将两个偏振态分离形成光路a和光路b。作为上述技术方案的进一步描述：所述光路a上依次设有第一扩束器、第一反射镜、第二反射镜、第一聚焦透镜和第三反射镜；所述光路b上依次设有第二扩束器和第二聚焦透镜。作为上述技术方案的进一步描述：所述显微成像系统包括样品、显微物镜、二向色分光镜、第三聚焦透镜、第四反射镜、光阑、第四聚焦透镜、第五聚焦透镜、谐振扫描镜、第一共轭透镜组、第二共轭透镜组和光电传感器；所述二向色分光镜、显微物镜、样品在同一光路上；所述二向色分光镜的分光路上依次设有第三聚焦透镜、光阑、第四透镜、第五透镜、谐振扫描镜；所述谐振扫描镜的另一条光路上依次设有第一共轭透镜组、第二共轭透镜组和光电传感器。作为上述技术方案的进一步描述：所述第一共轭透镜组和第二共轭透镜组各包含N个分透镜，所述N个分透镜用于不同相位下的荧光光信号收集。作为上述技术方案的进一步描述：所述激光器光源为连续、单纵模的光源；各个调制器的转换频率至少1MHZ；谐振扫描镜扫描频率至少4kHz。作为上述技术方案的进一步描述：所述光路a从所述显微成像系统的样品上方进入样品；所述光路b进入所述成像系统的二向色分光镜，通过显微成像系统的显微物镜进入样品。一种根据上述所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置的工作方法，包括如下步骤：a、首先将样品调整到显微物镜焦平面上；b、然后打开光源系统发射出激发光，激发光被照明及调制系统分为两路激光并在样品处产生干涉条纹，同时激发样品；c、样品所发出的光信号经过显微成像系统进行收集，并汇聚在谐振扫描镜镜面上，经谐振扫描镜快速扫描，通过N组共轭透镜组中的第一组透镜汇聚到光电传感器靶面子区域位置1处，然后对荧光光信号进行积分；然后照明及调制系统改变激发光相位并激发样品，样品发射出光信号通过显微成像系统收集后汇聚在谐振扫描镜镜面镜面上，经谐振扫描镜镜面快速扫描，通过N组共轭透镜组中的第二组透镜汇聚到光电传感器靶面子区域位置2处，然后对荧光光信号进行积分，依次循环，照明及调制系统改变激发光相位N次，完成一个周期；d、在光电传感器曝光过程中，重复步骤c若干个周期，最终在曝光结束得到荧光图像；其中，所述荧光图像包含N个荧光子图像；e、根据得到的荧光子图像中同一个单分子在不同荧光子图像中的亮度计算单分子的相位，并通过相位转换为轴向位置，实现对单分子的轴向定位。作为上述技术方案的进一步描述：所述荧光光信号聚焦在谐振扫描镜镜面上，并且谐振扫描镜镜面处于共轭透镜组的焦点处。作为上述技术方案的进一步描述：所述显微成像系统与照明及调制系统同步控制，光信号投射在光电传感器每个子区域上时，照明及调制系统将样品处的干涉图样调制到对应的相位。作为上述技术方案的进一步描述：当样品发射的光信号处于共轭透镜组中透镜的交界处时，激发光处于关闭状态；当样品发射的光信号完全位于某一组共轭透镜组中透镜的通光孔径内时，激发光处于打开状态。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提出了一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法，即激发光分为两路从相对位置照射样品，在样品处产生轴向干涉同时对样品的荧光分子进行激发。通过照明图案的相位和光源强度快速切换，实现不同相位的图像同时采集，然后对单分子在不同照明图案下的亮度计算其相对于照明条纹的相位，再通过相位对位置进行解析，从而实现更高的轴向定位精度。利用该技术可以实现对单分子的轴向位置测量，相比以往的定位方法具有精度高且不受干涉长度的影响等优点。附图说明图1为本专利技术提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置的结构示意图；图2为本专利技术提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置的图像采集流程示意图；图3为本专利技术提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置的工作方法中图像处理流程示意图；图4为本专利技术提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置采集的每幅荧光图像中得到的三个荧光子图像。其中：1-光源系统；2-照明及调制系统；3-显微成像系统；4-信号控制处理系统；1-1-激光器；1-2-声光调制器；1-3-1/2波片；2-1-电光调制器；2-2-偏振分光镜；2-3-第一扩束器；2-4-第一反射镜；2-5-第二反射镜；2-6-第一聚焦透镜；2-7-第三反射镜；2-8-第二扩束器；2-9-第二聚焦透镜；3-1-样品；3-2-显微物镜；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，包括：/n光源系统，其用于提供激发光；/n照明及调制系统，其与所述光源系统光路连接，所述照明及调制系统用于将激光分为两个光路并在样品处汇聚产生干涉图样，同时调制图样的相位；/n显微成像系统，其与所述照明及调制系统光路连接，所述显微成像系统用于收集样品产生的光信号并将收集的光信号汇聚到光电传感器的不同区域；/n信号控制处理系统；其分别与光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统连接，以对光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统进行同步有序控制。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，包括：
光源系统，其用于提供激发光；
照明及调制系统，其与所述光源系统光路连接，所述照明及调制系统用于将激光分为两个光路并在样品处汇聚产生干涉图样，同时调制图样的相位；
显微成像系统，其与所述照明及调制系统光路连接，所述显微成像系统用于收集样品产生的光信号并将收集的光信号汇聚到光电传感器的不同区域；
信号控制处理系统；其分别与光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统连接，以对光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统进行同步有序控制。


2.根据权利要求1所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，所述光源系统包括激光器，在激光器的光路上依次设置有强度调制器和1/2波片，通过激光器发出的激光经过强度调制器控制光强，通过1/2波片控制偏振状态后进入到调制系统中。


3.根据权利要求2所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，所述强度调制器为声光调制器。


4.根据权利要求2所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，所述照明及调制系统包括电光调制器和偏振分光镜，由所述光源系统发出的激光经过所述电光调制器调制光束中两个偏振态之间的相位差，之后经过所述偏振分光镜将两个偏振态分离形成光路a和光路b。


5.根据权利要求4所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，所述光路a上依次设有第一扩束器、第一反射镜、第二反射镜、第一聚焦透镜和第三反射镜；所述光路b上依次设有第二扩束器和第二聚焦透镜。


6.根据权利要求2所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置，其特征在于，所述显微成像系统包括样品、显微物镜、二向色分光镜、第三聚焦透镜、第四反射镜、光阑、第四聚焦透镜、第五聚焦透镜、谐振扫描镜、第一共轭透镜组、第二共轭透镜组和光电传感器；所述二向色分光镜、显微物镜、样品在同一光路上；所述二向色分光镜的分光路上依次设有第三聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷陆生，纪伟，徐涛，付彦辉，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11