一种定量DNA甲基化程度的电化学方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种定量DNA甲基化程度的电化学方法及系统，通过使用电化学工作站测试样本DNA的电流吸附率，可以很好地反应出样本DNA的甲基化程度，并基于该结果进一步确定样本的肿瘤风险。本发明专利技术一些实例的检测方法，具有：1)高灵敏度，最少只需要200μL的血浆样本就足以进行检测；2)无需对DNA进行预处理；3)检测时间短，10分钟左右即可完成检测；4)检测费用低，除DNA提取外检测成本低于1元；有望开发为即时检测的检测技术。

【技术实现步骤摘要】
一种定量DNA甲基化程度的电化学方法及系统
本专利技术涉及一种DNA甲基化程度的定量方法，特别涉及一种定量cfDNA甲基化程度的电化学方法及系统。
技术介绍
DNA甲基化是最早发现的基因修饰之一，广泛存在于各物种中，是一种重要的遗传外修饰，是静观遗传学的重要组成部分，参与了动物胚胎发育、基因印迹和X染色体失活等过程，在基因表达的调控中具有重要作用，异常甲基化可以导致肿瘤的形成。对DNA甲基化程度进行检测，具有非常重要意义。已有的DNA甲基化方法有有机小分子检测法、生物分析方法，(参见赖涵,翁小成.DNA甲基化检测研究进展[J].2012.)。实际使用的cfDNA甲基化检测技术大部分基于PCR技术，包括甲基化荧光定量PCR、甲基化数字滴度PCR和甲基化二代测序。这些技术存在的缺点为：1)需要DNA预处理。进行检测前需要进行DNA预处理，如亚硫酸盐转化和PCR扩增；2)费用较为昂贵。目前的甲基化荧光定量PCR检测一次费用大概为500-1000元，甲基化数字滴度PCR单次检测光耗材成本50美元，甲基化二代测序的费用更为昂贵；3)检测时间较长。甲基化荧光定量PCR通常需要2个小时(不包括DNA预处理)。甲基化数字滴度PCR通常需要4～6小时(不包括DNA预处理)。甲基化二代测序需要的时间更长，通常大于3天；4)样本需求量大。三种检测方式需要1ml甚至更多的血浆样本。DNA电化学分析方法拥有诸多优势，如检测时间短、操作简单、费用低、易于小型化，且能够可以与其他技术如光化学联用，形成可视化的即时检测方法。日前已经有多篇文献报道应用于DNA甲基化水平和甲基化转移酶活性的分析。根据分析原理不同，主要分为：DNA甲基化的直接电化学分析、间接电化学分析、电致化学发光分析及光电化学分析(参见杨引,樊梦醒,郭智慧,等.DNA甲基化电化学分析[J].化学进展,2014,026(012):1977-1986.)。现有的电化学法DNA甲基化检测技术存在以下缺点：1)需要进行识别层的修饰，例如探针、受体等；2)需要进行DNA的预处理，包括亚硫酸盐转化和PCR扩增；3)由于需要DNA的预处理，因此整体检测时间较长，降低了检测的整体效率。液体活检技术在恶性肿瘤临床中主要用于恶性肿瘤的诊断、疗效监测、药物筛选和预后评估。相对于组织检测，液体活检具有无创、可重复、持续检测等诸多优势。相对于传统的肿瘤标记物，液体活检技术具有更高的灵敏性以及特异性。cfDNA是人体细胞包括肿瘤细胞释放到外周循环系统的游离DNA片段，也存在甲基化修饰，且甲基化的程度可以反应肿瘤的状况。对于cfDNA中肿瘤来源的DNA片段进行检测是目前恶性肿瘤液体活检的重要组成部分。开发出一种免标记、快捷、低成本的DNA甲基化程度检测方法，具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种免标记的DNA甲基化检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种DNA甲基化的电化学检测方法，包括：S1)获取待测DNA样本；S2)将待测DNA样本溶解于水性缓冲液中，得到DNA溶液；优选的，所述水性缓冲液为TE缓冲液，更佳为pH＝8.0的TE缓冲液；S3)将电化学工作站的工作电极、参比电极和对电极浸没于电解液中，确定吸附前的DPV电流峰值作为基线电流A0，所述电解液为添加有水溶性铁氰化盐和水溶性亚铁氰化盐的缓冲液；优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液；S4)将工作电极浸入所述DNA溶液中并充分吸附，测试吸附后的DPV电流峰值，记为样本电流A1；S5)根据基线电流A0和样本电流A1，计算DNA甲基化程度；其中，检测过程中维持恒温，所述工作电极为金电极。在一些实例中，检测过程中的温度维持在10～30℃，优选为15～25℃，18～22℃、更佳约为20℃。在一些实例中，水溶性铁氰化盐选自[K3Fe(CN)6]、[Na3Fe(CN)6]；水溶性亚铁氰化盐选自[K4Fe(CN)6]或[Na4Fe(CN)6]。在一些实例中，水溶性铁氰化盐和水溶性亚铁氰化盐的摩尔比为(0.95～1.05)：1，优选为1：1。在一些实例中，电化学工作站DPV模式的检测参数为：tequilibration＝0s、Ebegin＝-0.1V、Eend＝0.5V、Estep＝0.005V、Epulse＝0.05V、tpulse＝0.05s、Scanrate＝0.05V/s、Currentrange＝1uA–1mA。在一些实例中，DNA电流吸附率的计算公式为：在一些实例中，当计算得到的DNA电流吸附率低于10％时，对样本进行复核。在一些实例中，使用磁珠吸附法提取获得待测DNA样本。在一些实例中，所述待测DNA样本包括血浆cfDNA样本、组织DNA样本。本专利技术的第二个方面，提供：一种肿瘤筛查系统，包括：样本DNA甲基化程度检测装置，用于实现本专利技术第一个方面所述的方法，确定样本DNA甲基化程度；结果判断装置：基于样本DNA甲基化程度，筛查恶性肿瘤。在一些实例中，定样本DNA甲基化程度以电流吸附率计。在一些实例中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、食管癌、淋巴瘤、胃癌、白血病、胰腺癌、肝癌、肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆囊癌、宫颈癌等。本专利技术的有益效果是：本专利技术一些实例的检测方法，具有：1)高灵敏度，最少只需要200μL的血浆样本就足以进行检测；2)无需对DNA进行预处理；3)检测时间短，10分钟左右即可完成检测；4)检测费用低，除DNA提取外检测成本低于1元；有望开发为即时检测的检测技术。附图说明图1是不同甲基化程度DNA在金表面覆盖面积的对比情况；图2是不同甲基化程度DNA在金表面覆盖高度的对比情况；图3是不同甲基化程度DNA的电化学检测结果；图4是正常DNA和癌cfDNA的电化学检测结果；图5是短片段DNA的电化学检测结果；图6是不同DNA缓冲液对电化学检测结果的影响；图7是不同DNA提取方法对电化学检测结果的影响；图8是不同温度对电化学检测结果的影响；图9是电化学检测方法的检测精准度的实验结果；图10是不同甲基化水平DNA吸附率情况；图11是不同组织的电化学检测结果；图12是组织吸附率的ROC曲线；图13是多种肿瘤的血浆cfDNA检测结果；图14是血浆吸附率的ROC曲线。具体实施方式方便比较起见，部分操作如下：DNA准备：组织DNA准备：所有肿瘤组织及正常组织均经过常规病理取材、脱水、石蜡包埋，切片后经HE染色，由两名不同的病理医生共同确认癌组织和正常组织区域后，对癌组织切片进行癌组织富集。组织DNA提取使用QIAampDNA组织提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行。用试剂盒中eluti本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA甲基化的电化学检测方法，包括：/nS1)获取待测DNA样本；/nS2)将待测DNA样本溶解于水性缓冲液中，得到DNA溶液；优选的，所述水性缓冲液为TE缓冲液，更佳为pH＝8.0的TE缓冲液；/nS3)将电化学工作站的工作电极、参比电极和对电极浸没于电解液中，确定吸附前的DPV电流峰值作为基线电流A0，所述电解液为添加有水溶性铁氰化盐和水溶性亚铁氰化盐的缓冲液；优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液；/nS4)将工作电极浸入所述DNA溶液中并充分吸附，测试吸附后的DPV电流峰值，记为样本电流A1；/nS5)根据基线电流A0和样本电流A1，计算DNA甲基化程度；/n其中，检测过程中维持恒温，所述工作电极为金电极。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化的电化学检测方法，包括：
S1)获取待测DNA样本；
S2)将待测DNA样本溶解于水性缓冲液中，得到DNA溶液；优选的，所述水性缓冲液为TE缓冲液，更佳为pH＝8.0的TE缓冲液；
S3)将电化学工作站的工作电极、参比电极和对电极浸没于电解液中，确定吸附前的DPV电流峰值作为基线电流A0，所述电解液为添加有水溶性铁氰化盐和水溶性亚铁氰化盐的缓冲液；优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液；
S4)将工作电极浸入所述DNA溶液中并充分吸附，测试吸附后的DPV电流峰值，记为样本电流A1；
S5)根据基线电流A0和样本电流A1，计算DNA甲基化程度；
其中，检测过程中维持恒温，所述工作电极为金电极。


2.根据权利要求1所述的化学检测方法，其特征在于：检测过程中的温度维持在10～30℃，优选为15～25℃，更佳约为20℃。


3.根据权利要求1所述的化学检测方法，其特征在于：水溶性铁氰化盐选自[K3Fe(CN)6]、[Na3Fe(CN)6]；水溶性亚铁氰化盐选自[K4Fe(CN)6]或[Na4Fe(CN)6]。


4.根据权利要求1～3任一项所述的化学检测方法，其特征在于：水溶性铁氰化盐和水溶性亚铁氰化盐的摩尔比为(0.95～1.05)：1，优选为1：1。


5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙经纬，
申请(专利权)人：孙经纬，
类型：发明
国别省市：广东;44