一种NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种简便的NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法，适用于发酵领域、临床医学以及食品工程中NADH或乙醇的检测。本发明专利技术所述传感材料制备方法简单，可批量制备，纳米金在铁氰化镍表面分布均匀，基于该材料制备的传感芯片质量可控。该传感芯片以乙醇脱氢酶作为生物识别元件，选择性更高。该传感芯片对乙醇和NADH检测线性范围宽，检测无需稀释，单次检测时间＜30s可实现对发酵液的实时监测。

【技术实现步骤摘要】
一种NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法
本专利技术涉及一种简便的NADH及乙醇生物传感器的制备方法，适用于发酵领域、临床医学以及食品工程中NADH或乙醇的检测。
技术介绍
近年来，随着经济的高速发展，可持续理念与能源、环境等问题日益凸显。推广使用燃料乙醇是缓解能源、环境的一项重要的战略性举措。燃料乙醇作为全球最成功的生物质能源代替品种，在美国、巴西、欧盟等国家和地区都已形成新的能源产业。我国燃料乙醇产业始于“十五”期间，经过十多年的发展，已经成为继美国和巴西之后，全球生物燃料乙醇的第三生产大国和使用国。作为乙醇的最重要来源，乙醇发酵得到了广泛的关注。在乙醇发酵过程中，乙醇的浓度是发酵的主要参数之一，一方面会影响酵母的生长，另一方面影响参与到发酵过程中的各种酶的催化性能。一般来说，当乙醇的浓度达到14%时，发酵过程就会停止。因此，对乙醇浓度的检测在发酵领域显得尤为重要。传统检测乙醇的方法有分光光度计、色谱法、比色法等，这类方法通常需要前处理，以及检测的时间较长，检测结果滞后，无法得到实时的浓度值。电化学传感器由于操作便捷、成本较低、性能稳定、准确度高等优点而受到广泛关注。电化学传感器的核心在于传感电极，包括高性能传感材料的开发和传感芯片的制备。目前还没有文献报导将生物传感器用在乙醇和NADH实时检测的研究成果，乙醇和NADH在线实时监测的技术也尚处于研究空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于制备一种乙醇生物传感器，用于发酵中乙醇浓度的精准检测，该生物传感器的制备工艺简单、成本较低并具有很好的应用价值。本专利技术的技术方案为：一种生物传感器，其制备步骤包括：1)铁氰化镍的合成液A，B的配置及合成，具体包括：合成液A为一种阴离子酸溶液，合成液B为一种阳离子酸溶液，为形成均一的立方颗粒，两种合成液pH值和离子浓度需相同。所合成的A、B溶液利用微量注射泵，以相同的滴加速率向烧杯中同时滴加生成结晶反应。待滴加结束后，搅拌一定时间，再次以相同速率滴加一定量的B溶液，滴加完毕后将合成液离心清洗，清洗数次后转入烧杯，加入去离子水即得到铁氰化镍悬浊液。2)金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨的合成，具体包括：利用微量注射泵向铁氰化镍悬浊液中滴加氯金酸溶液，待滴加完毕后向悬浊液中滴加具有还原性的溶液，待滴加结束后离心清洗、烘干后得到金纳米颗粒/铁氰化镍混合粉末。将金纳米颗粒/铁氰化镍混合粉末与碳油墨以一定质量比混合均匀，得到金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨。3)生物传感芯片的印刷，具体可包括：将金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨通过丝网印刷技术固定到支撑体上形成工作电极。配制含有一定量戊二醛的乙醇脱氢酶混合溶液。取出一定量的混合酶溶液均匀涂于工作电极上，置于冰箱低温干燥得到用于乙醇检测的生物传感芯片。作为优选，步骤1中合成液A、合成液B中的离子浓度范围均为0.001-0.1M，pH值均为1-6；结晶反应温度为10-60℃；合成液A、合成液B的注射速度均为100-1000μL/min。作为优选，步骤1中阴离子供体为K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]中的一种，阳离子供体为NiCl2、NiSO4、Ni(NO3)2中的一种；酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸中的一种。作为优选，步骤1中搅拌时间为10min-1h，B溶液滴加的体积为30-90ml。作为优选，步骤1中离心速率为5000r/min-10000r/min,离心时间为3min-15min，离心次数为2-5次，去离子水体积为10-100mL。作为优选，步骤2中所述还原性溶液为柠檬酸钠、抗坏血酸、葡萄糖中的一种。作为优选，步骤2中，氯金酸与还原性溶液中还原性物质的摩尔比为1:5-1:15。作为优选，步骤2中金纳米颗粒/铁氰化镍粉末与碳油墨质量比为1:5-1:20；步骤3中支撑体是PVC、PET、氧化铝中的至少一种。作为优选，步骤3中乙醇脱氢酶溶液的浓度为0.1-1U/μL，戊二醛在混合酶溶液中所占体积百分比为0.5％-2％，涂覆于工作电极上的混合酶溶液为1-5µl，乙醇生物传感芯片在0-10℃下干燥。本专利技术提出一种乙醇和/或NADH检测方法，采用上述方法制得的生物传感芯片进行检测。本专利技术提出上述制备方法得到的生物传感芯片在乙醇和/或NADH检测中的应用。利用电化学方法检测乙醇主要是依靠电极材料在一定电压下催化氧化NADH并产生电流，通过该电流反应乙醇的含量。而铁氰化镍具有良好的催化性能，可以有效的催化氧化NADH。本专利以铁氰化镍为传感材料，并引入金纳米颗粒提高材料的导电性，通过对材料纳米结构的控制，得到了具有对NADH高催化选择性的纳米复合材料-金纳米颗粒/铁氰化镍，并结合丝网印刷技术制备出乙醇生物传感器。得益于该材料的优异电催化性能、稳定性以及生物相容性，所制备的生物传感器相较于现有的传感器有更高的检测范围，实现无稀释的检测发酵液中的乙醇。本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术所述传感材料制备方法简单，可批量制备，纳米金在铁氰化镍表面分布均匀，基于该材料制备的传感芯片质量可控。2.该传感芯片以乙醇脱氢酶作为生物识别元件，选择性更高。3.该传感芯片对乙醇和NADH检测线性范围宽，检测无需稀释，单次检测时间＜30s可实现对发酵液的实时监测。附图说明图1为金纳米颗粒/铁氰化镍电镜图。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。下面对本专利技术的技术方案进行详细的说明。实施例1一种乙醇生物传感芯片，制备过程如下：1）配制0.001M的K3[Fe(CN)6]和0.001M的NiCl2·6H2O溶液，分别用盐酸调整溶液pH至6，得到盐酸溶液。采用微速化学合成法合成铁氰化镍前驱液：分别取出两种盐酸溶液90ml固定在注射泵上，合成温度10℃，注射速度均为100µL/min。本实施案列所采用的低注射速率可降低晶体的结晶速率，得到更加规整的颗粒。注射完毕后，搅拌15min，再以100µL/min的速率滴加90mLNiCl2·6H2O盐酸溶液。待滴加完毕后离心，混合液离心的速率为5000r/min，离心时间10min。再用去离子水离心清洗2次，去离子水没过固体即可，体积可变，对产品没有影响。离心速率5000r/min，每次15min，离心清洗结束后将所得固体重新分散在100mL去离子水中，即可得到铁氰化镍悬浊液。2）配置2mMHAuCl4溶液和10mM柠檬酸钠溶液，取20mLHAuCl4溶液固定在注射泵中，以100µL/min的注射速率向1）的铁氰化镍悬浊液中滴加，滴加完毕后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：/n步骤1：合成液A、合成液B的配制及铁氰化镍的合成/n合成液A为一种阴离子酸溶液，合成液B为一种阳离子酸溶液，且与合成液A的pH值和离子浓度相同；合成液A与合成液B以相同的速率滴加混合反应,滴加完毕后，搅拌；然后继续以相同速率滴加合成液B，离心，清洗若干次后转入去离子水中得到铁氰化镍悬浊液；/n步骤2：金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨的合成/n向铁氰化镍悬浊液中滴加氯金酸溶液，滴加完毕后继续滴加具有还原性的溶液，滴加结束后离心清洗、烘干后得到金纳米颗粒/铁氰化镍混合粉末；粉末中加入碳油墨混合均匀，得到金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨；/n步骤3：生物传感芯片的制备/n将步骤2中制得的金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨通过丝网印刷技术，固定到支撑体上形成工作电极；戊二醛加入乙醇脱氢酶溶液中制得混合酶溶液；并均匀涂于工作电极上，低温干燥条件下得到生物传感芯片。/n

【技术特征摘要】
1.一种NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
步骤1：合成液A、合成液B的配制及铁氰化镍的合成
合成液A为一种阴离子酸溶液，合成液B为一种阳离子酸溶液，且与合成液A的pH值和离子浓度相同；合成液A与合成液B以相同的速率滴加混合反应,滴加完毕后，搅拌；然后继续以相同速率滴加合成液B，离心，清洗若干次后转入去离子水中得到铁氰化镍悬浊液；
步骤2：金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨的合成
向铁氰化镍悬浊液中滴加氯金酸溶液，滴加完毕后继续滴加具有还原性的溶液，滴加结束后离心清洗、烘干后得到金纳米颗粒/铁氰化镍混合粉末；粉末中加入碳油墨混合均匀，得到金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨；
步骤3：生物传感芯片的制备
将步骤2中制得的金纳米颗粒/铁氰化镍/碳混合油墨通过丝网印刷技术，固定到支撑体上形成工作电极；戊二醛加入乙醇脱氢酶溶液中制得混合酶溶液；并均匀涂于工作电极上，低温干燥条件下得到生物传感芯片。


2.根据权利要求书1所述NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤1中合成液A、合成液B中的离子浓度范围均为0.001-0.1M，pH值均为1-6；结晶反应温度为10-60℃；合成液A、合成液B的注射速度均为100-1000μL/min。


3.根据权利要求书1所述NADH及乙醇生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤1中阴离子供体为K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]中的一种，阳离子供体为NiCl2、NiSO4、Ni(...

【专利技术属性】
技术研发人员：储震宇，张思健，金万勤，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32