刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法技术

本发明专利技术涉及刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法。获取刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列，通过对这些序列进行多重比对，获得相对保守的区域以及变异较大的区域，在相对保守的区域设计相互嵌套引物，即第一对引物的下游引物应在第二对引物的上游引物之后，保证扩增出的产物之间相互重叠。由此获得的刺鮈线粒体基因组全序列的扩增引物可用于种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源评估等方面。

【技术实现步骤摘要】
刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法
本专利技术属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法。
技术介绍
刺鮈(AcanthogobioguentheriHerzenstein)属鲤形目、鲤科、鮈亚科、刺鮈属、别名金鱼(青海民和)，小型鱼类，是刺鮈属唯一种，为中国特有鱼类。刺鮈体较高而侧扁，背鳍前部较隆起，腹部圆，尾柄粗短。头短而尖，头长通常小于体高。吻尖，呈锥形，吻长稍短于眼后头长。口下位，呈弧形，唇简单，无乳突。唇后沟中断。背鳍最后不分枝鳍条为一光滑的硬刺，端部柔软，其长度较头长为短。胸鳍长，个体较小者末端可伸达腹鳍起点。腹鳍位于背鳍起点稍后的下方，末端不达臀鳍。臀鳍短，无硬刺，其起点距腹鳍基较距尾鳍基稍近。尾鳍分叉，两叶，末端尖。肛门靠近臀鳍起点。侧线完全，平直。体背部呈褐色或淡褐色，背部正中有一条黑色的条纹。体侧中轴之上方有一列黑色斑点。背鳍和尾鳍呈灰黑色，并具黑色斑点，其他各鳍灰白色。据记载，在青海共和曲沟至甘肃兰州等黄河干支流均有分布，是黄河上游重要的土著鱼类资源。黄河青海段土著鱼类体表具明显鳞片的鱼类只有三种，鲤科雅罗鱼亚科黄河雅罗鱼、鲤科鮈亚科黄河鮈和刺鮈。鱼类线粒体基因组由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因(12SrRNA及16SrRNA)共37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其在种类鉴别、系统进化和种群遗传学的研究方面应用十分广泛。由于拦河筑坝、水体污染、过度捕捞等人为因素干扰以及刺鮈生活环境的改变，刺鮈个体趋于低龄化、小型化，且鱼类资源量急剧下降，遗传多样性降低。鲤科雅罗鱼亚科黄河雅罗鱼和鲤科鮈亚科黄河鮈在青海境内已基本采集不到，仅剩下刺鮈目前在十分有限的水域分布，已列入《中国物种红色名录》易危物种。目前，必须采取有效的措施来保护和恢复急剧衰退的刺鮈自然群体资源。但现阶段，关于刺鮈的研究，主要集中于蛋白质组学和资源生物学领域，而采用分子生物学技术对刺鮈的研究不多，且关于其线粒体基因组全序列扩增的引物和方法尚未报道。考虑到目前刺鮈遗传学尤其是线粒体基因组方面的信息量有限，开展其线粒体基因组全序列的研究就显得十分必要。
技术实现思路
针对现有技术的空白，本专利技术提供了一种刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法。利用该引物可一次性扩增出刺鮈线粒体基因组，通过测序和拼接能够快速获得其基因组全序列，该方法具有简便、快捷、高效等优点。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种刺鮈线粒体基因组全序列扩增引物的设计方法，获取刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列，通过对这些序列进行多重比对，获得相对保守的区域以及变异较大的区域，在相对保守的区域设计相互嵌套引物，即第一对引物的下游引物应在第二对引物的上游引物之后，保证扩增出的产物之间相互重叠。按上述方案，所述刺鮈近缘物种为薄身罗马诺鮈(Romanogobiotenuicorpus)、蛇鮈(Saurogobiodabryi)、犬首鮈(Gobiocynocephalus)、似鮈(Pseudogobiovaillanti)。按上述方案，所述刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列从Genbank数据库中下载获得。按上述方案，所述的相对保守的区域为无突变位点或仅1个突变位点的保守序列区域按上述方案，相邻引物对之间扩增出的产物序列至少有100bp的重叠区域。即第一对引物的下游引物嵌套于第二对引物的上游引物之后，如此反复，以利于后期序列的拼接，同时避免PCR和测序过程可能导致的突变位点，确保了PCR扩增的成功率和扩增目的序列的准确性。一种刺鮈线粒体基因组全序列扩增引物组，包括二十对引物，其中第一对引物：上游引物1如SEQIDCJ01-F所示：5’-CACTGAAGATGTTAAGATG-3’；下游引物1如SEQIDCJ01-R所示：5’-GTCTTCTCGGTGTAAGTGAG-3’；第二对引物：上游引物2如SEQIDCJ02-F所示：5’-GGCTCTAAGGCGCGTACAC-3’；下游引物2如SEQIDCJ02-R所示：5’-TCCAGTGTGGGGTTAACGAT-3’；第三对引物：上游引物3如SEQIDCJ03-F所示：5’-AGCACAAGTGTAAACCAGATCG-3’；下游引物3如SEQIDCJ03-R所示：5’-GAAGAGGATTTGAACCTCTGGT-3’；第四对引物：上游引物4如SEQIDCJ04-F所示：5’-CTGTAACGCTACTTTTCCTAGT-3’；下游引物4如SEQIDCJ04-R所示：5’-TATAAGCCACTCTATCAAAGTG-3’；第五对引物：上游引物5如SEQIDCJ05-F所示：5’-CTTGTATGGAAAAACTTCCT-3’；下游引物5如SEQIDCJ05-R所示：5’-GCTTTGAAGGCTCTTGGTCT-3’；第六对引物：上游引物6如SEQIDCJ06-F所示：5’-GCCACAAAAATTAATACCCT-3’；下游引物6如SEQIDCJ06-R所示：5’-CCTAAAATTGATGAAACAC-3’；第七对引物：上游引物7如SEQIDCJ07-F所示：5’-CTTTATAGTAATACCAATTCT-3’；下游引物7如SEQIDCJ07-R所示：5’-AAATAGGAACATAATTACTGC-3’；第八对引物：上游引物8如SEQIDCJ08-F所示：5’-ACTTGAACAAAAATCCACTT-3’；下游引物8如SEQIDCJ08-R所示：5’-CCACAGATTTCAGAGCATTG-3’；第九对引物：上游引物9如SEQIDCJ09-F所示：5’-ACCTAACAATTAAAGCCATAG-3’；下游引物9如SEQIDCJ09-R所示：5’-ATGCATGTGCTTGGTGTGCCAT-3’；第十对引物：上游引物10如SEQIDCJ10-F所示：5’-GCCAGTACTAATTATTATCG-3’；下游引物10如SEQIDCJ10-R所示：5’-ATGGATACGTAAAGGAATAGT-3’；第十一对引物：上游引物11如SEQIDCJ11-F所示：5’-CAATACCACTTCACATCTGAAC-3’；下游引物11如SEQIDCJ11-R所示：5’-AGGTTTAGGTTTTGTAGGCG-3’；第十二对引物：上游引物12如SEQIDCJ12-F所示：5’-CTTGGCCTAATAGGACTAGC-3’；下游引物12如SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.刺鮈线粒体基因组全序列引物的设计方法，其特征在于：获取刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列，通过对这些序列进行多重比对，获得相对保守的区域以及变异较大的区域，在相对保守的区域设计相互嵌套引物，即第一对引物的下游引物应在第二对引物的上游引物之后，保证扩增出的产物之间相互重叠。/n

【技术特征摘要】
1.刺鮈线粒体基因组全序列引物的设计方法，其特征在于：获取刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列，通过对这些序列进行多重比对，获得相对保守的区域以及变异较大的区域，在相对保守的区域设计相互嵌套引物，即第一对引物的下游引物应在第二对引物的上游引物之后，保证扩增出的产物之间相互重叠。


2.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于：所述刺鮈近缘物种为薄身罗马诺鮈(Romanogobiotenuicorpus)、蛇鮈(Saurogobiodabryi)、犬首鮈(Gobiocynocephalus)、似鮈(Pseudogobiovaillanti)。


3.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于：所述刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列从Genbank数据库中下载获得。


4.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于：所述的相对保守的区域为无突变位点或仅1个突变位点的保守序列区域。


5.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于：相邻引物对之间扩增出的产物序列至少有100bp的重叠区域。


6.刺鮈线粒体基因组全序列引物组，其特征在于，包括二十对引物，其中
第一对引物：
上游引物1如SEQIDCJ01-F所示：5’-CACTGAAGATGTTAAGATG-3’；
下游引物1如SEQIDCJ01-R所示：5’-GTCTTCTCGGTGTAAGTGAG-3’；
第二对引物：
上游引物2如SEQIDCJ02-F所示：5’-GGCTCTAAGGCGCGTACAC-3’；
下游引物2如SEQIDCJ02-R所示：5’-TCCAGTGTGGGGTTAACGAT-3’；
第三对引物：
上游引物3如SEQIDCJ03-F所示：5’-AGCACAAGTGTAAACCAGATCG-3’；
下游引物3如SEQIDCJ03-R所示：5’-GAAGAGGATTTGAACCTCTGGT-3’；
第四对引物：
上游引物4如SEQIDCJ04-F所示：5’-CTGTAACGCTACTTTTCCTAGT-3’；
下游引物4如SEQIDCJ04-R所示：5’-TATAAGCCACTCTATCAAAGTG-3’；
第五对引物：
上游引物5如SEQIDCJ05-F所示：5’-CTTGTATGGAAAAACTTCCT-3’；
下游引物5如SEQIDCJ05-R所示：5’-GCTTTGAAGGCTCTTGGTCT-3’；
第六对引物：
上游引物6如SEQIDCJ06-F所示：5’-GCCACAAAAATTAATACCCT-3’；
下游引物6如SEQIDCJ06-R所示：5’-CCTAAAATTGATGAAACAC-3’；
第七对引物：
上游引物7如SEQIDCJ07-F所示：5’-CTTTATAGTAATACCAATTCT-3’；
下游引物7如SEQIDCJ07-R所示：5’-AAATAGGAACATAATTACTGC-3’；
第八对引物：
上游引物8如SEQIDCJ08-F所示：5’-ACTTGAACAAAAATCCACTT-3’；
下游引物8如SEQIDCJ08-R所示：5’-CCACAGATTTCAGAGCATTG-3’；
第九对引物：
上游引物9如SEQIDCJ09-F所示：5’-ACCTAACAATTAAAGCCATAG-3’；
下游引物9如SEQIDCJ09-R所示：5’-ATGCATGTGCTTGGTGTGCCAT-3’；
第十对引物：
上游引物10如SEQIDCJ10-F所示：5’-GCCAGTACTAATTATTATCG-3’；
下游引物10如SEQIDCJ10-R所示：5’-ATGGATACGTAAAGGAATAGT-3’；
第十一对引物：
上游引物11如SEQIDCJ11-F所示：5’-CAATACCACTTCACATCTGAAC-3’；
下游引物11如SEQIDCJ11-R所示：5’-AGGTTTAGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：阙延福，汪鄂洲，李伟涛，朱滨，邵科，廖小林，闫书详，胡兴坤，
申请(专利权)人：水利部中国科学院水工程生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42