检测广州管圆线虫的引物和试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒。该检测广州管圆线虫的引物，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。该引物可以基于RPA等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
检测广州管圆线虫的引物和试剂盒
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒。
技术介绍
广州管圆线虫(又称广东住血线虫，Angiostrongyluscantonensis)是一种呈世界性分布的人兽共患线虫病，拥有众多中间宿主，可以感染包括人类在内的几乎所有的温血动物。广州管圆线虫可引起人广州管圆线虫病，导致嗜酸性脑膜炎等中枢神经系统疾病，严重时出现认知障碍，精神错乱，嗜睡昏迷以及死亡。广州管圆线虫广泛分布在世界各洲并且集中分布在亚太地区，在中国的云南、浙江、广东、福建等南部地区均有流行。福寿螺、褐云玛瑙螺、藁杆双脐螺及蛞蝓是广州管圆线虫的主要中间宿主，它引发的人畜寄生虫病每年造成巨大的经济损失。与此同时，螺类等水生动物的寄生虫检测在寄生虫病的防控中尤为重要，广州管圆线虫中间宿主具体的检测方法包括病原学诊断法和分子生物学诊断法。如肺检法和胃蛋白酶消化法等病原学检测检出率低，对于低度感染的中间宿主一般很难检查出来，导致较高的漏检率。而要检测低度感染的中间宿主则需要具有高灵敏度优势的实验室方法。随着分子生物学的迅速发展，DNA探针技术、DNA聚合酶链式反应及实时荧光定量PCR等分子生物学检测技术相继被开发和应用在寄生虫领域。分子生物学诊断技术是指以DNA和RNA为诊断模板，使用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对疾病作出诊断的技术。它的基本原理是检测受检样本中目标DNA或RNA的含量变化、结构变化及表达功能是否异常，来确定有无基因水平的异常变化，对寄生虫病的防控具有重大意义。目前广州管圆线虫的分子生物学检测技术已经日趋成熟，能够较为精确且可靠的检测感染程度较低的中间宿主。但是，由于分子检测技术需要昂贵的仪器设备、复杂的实验程序及专门的实验室环境等一系列原因，同时广州管圆线虫流行于缺少专业实验室设备支持的亚热带和热带地区及一些岛屿国家，因此野外检测非常困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒，旨在解决现有广州管圆线虫野外检测困难的技术问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供一种检测广州管圆线虫的引物，包括：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。本专利技术提供的用于检测广州管圆线虫的引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18sRNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的引物对，可以基于重组酶聚合酶扩增(RecombinasePloymeraseAmplification，RPA)的等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。本专利技术另一方面提供一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增广州管圆线虫的引物，所述引物包括：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。本专利技术提供的试剂盒含有用于检测广州管圆线虫的引物，该引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18sRNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的引物对，可以基于RPA等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。附图说明图1是本专利技术实施例的扩增温度对RPA琼脂糖凝胶检测效果的影响；泳道1和泳道13为DL2000DNAMarker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2为空白对照；泳道3-10反应温度依次为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，扩增产物条带大小为461bp；泳道11为阴性对照；泳道12为阳性质控；图2是本专利技术实施例的扩增时间对RPA琼脂糖凝胶检测效果的影响；泳道1和泳道13为DL2000DNAMarker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-10的反应时间依次为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min和45min；泳道11为阴性对照；泳道12为阳性质控；图3是本专利技术实施例使用不同种属的虫体的总DNA进行RPA琼脂糖凝胶检测方法的特异性评价；泳道1和泳道15为DL2000DNAMarker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-11依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的DNA；泳道12为阳性对照；泳道13为阴性对照；泳道14为空白对照；图4是本专利技术实施例广州管圆线虫RPA琼脂糖凝胶检测方法灵敏性评价；泳道1，10和12为DL2000DNAMarker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-9依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg和2fg的DNA浓度；泳道11为阴性对照；图5是本专利技术实施例扩增温度对RPA联合侧流层析试纸条检测效果的影响；试纸条1为空白对照；试纸条2-10反应温度依次为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；试纸条11为阴性对照；试纸条12为阳性质控；图6是本专利技术实施例扩增时间对RPA联合侧流层析试纸条检测效果的影响；试纸条1-9反应时间依次为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min和45min；试纸条10为阴性对照；试纸条11为空白对照。图7是本专利技术实施例使用不同种属的虫体的总DNA进行RPA联合侧流层析试纸条检测方法的特异性评价；试纸条1-10依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的DNA；试纸条11为阳性对照；试纸条12为阴性对照；试纸条13为空白对照；试纸条14为试剂盒质控对照。图8是本专利技术实施例广州管圆线虫RPA联合侧流层析试纸条检测方法灵敏性评价；试纸条1-8依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg和2fg的DNA浓度；试纸条9为阳性对照。图9是本专利技术实施例用普通引物进行普通PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳结果；泳道1和5为DL2000DNAMarker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-4为广州管圆线虫DNA。图10是本专利技术实施例广州管圆线虫RPA琼脂糖凝胶检测方法在褐云玛瑙螺实际样本中的检测结果；泳道1和24为DL2000DNAMarker(2000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测广州管圆线虫的引物，其特征在于，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测广州管圆线虫的引物，其特征在于，包括：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括SEQIDNO.3所示的探针；其中，所述引物对的SEQIDNO.2序列5端连接有生物素，所述探针的5端连接有荧光素，所述探针的3端连有封闭基团，所述探针从5端开始的第31-32个碱基之间插入有四氢呋喃。


3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述荧光素为FAM，所示封闭基团为C3Spacer。


4.一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增广州管圆线虫的引物，其特征在于，所述引物包括：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为琼脂糖-RPA等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒还包括琼脂糖-RPA引物正控混合液、琼脂糖-RPA反应正控DNA模板，醋酸镁溶液和琼脂糖-RPA反应缓冲液。


6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增反应的体系为：29.5ulRehydrationBuffer缓冲液，11.2ulddH2O，2.4ulSEQIDNO.1所示的上游...

【专利技术属性】
技术研发人员：张仁利，郑惠文，黄达娜，陈木新，徐前明，陈家旭，艾琳，邓少玉，林梓丹，张倩，唐屹君，苏川，周晓农，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心深圳市卫生检验中心，深圳市预防医学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44