一种番茄红素含量的液相色谱-串联质谱检测方法技术

本发明专利技术公开了一种番茄红素含量的液相色谱‑串联质谱检测方法，包括：(1)待测样本溶液准备；(2)液相色谱分离；(3)串联质谱检测；(4)待测样本中番茄红素含量的确定；其中，步骤(3)中采用特定的番茄红素特征离子对。本发明专利技术确定的番茄红素特征离子对能够准确用于定性定量，所述方法稳定性和重复性好。

【技术实现步骤摘要】
一种番茄红素含量的液相色谱-串联质谱检测方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种番茄红素含量的液相色谱-串联质谱检测方法。
技术介绍
番茄红素是一种广泛存在于植物与动物中的一种类胡萝卜素，同时也是红色素的一种。因此在食品加工中常作为色素添加，同时也是抗氧化保健食品的原料。作为一种不饱和烯烃化合物，研究发现番茄红素具备多种生物学的作用，主要集中在抗氧化、降低心血管疾病风险、减少遗传损伤和抑制肿瘤发生发展等方面。因此在食品、化妆品、保健品生产加工上受到了广泛的认可。目前，对于番茄红素的提取分离方法大致可分为化学法、物理法和生物法。前两种方法是以相关化学及物理原理为基础的方法进行提取分离，例如萃取及皂化法。但是限于提取纯度及成本方面原因，可能导致这两种方法对于日益增长的市场需求响应不足。而微生物发酵法后来居上，慢慢成为番茄红素提取分离中的重要一环，并且采用藻类和真菌及酵母发酵制备番茄红素的成本及污染相对较低，提纯度较高，是生产番茄红素的有效方式。测定微生物发酵液中番茄红素含量，是评价工程菌株优劣和监控生产批次重要指标。目前对于番茄红素的检测主要利用分光光度法、薄层层析法及差示扫描量热法。这些方法难以区分检测物中复杂基质并且检测灵敏度不够。目前已有检测番茄红素的方法为基于光谱学原理进行，通过特定波长荧光进行扫描并用计算机记录信号。通过光谱信号从而达到番茄红素的检测效果。或者通过高效液相色谱的分离及光度检测器进行检测及记录。“番茄红素简便测定方法的建立”(张连富、丁霄霄，2001)，公开了采用紫外吸收光谱，以含2％二氯甲烷为溶剂、以502nm吸收峰为检测波长的番茄红素测定方法。“番茄红素检测方法的建立”(侯纯明、何美、周鑫，2007)，公开了采用紫外吸收光谱，以氯仿为溶剂、以518.8nm吸收峰为测定波长的番茄红素测定方法。但是上述现有技术的方法，检测精准度不够；并且，容易受到背景干扰。微生物发酵液具有成分复杂，干扰杂质多的特点。而准确地检测出番茄红素的含量对于生产和科研具有重要的指导意义。因此建立一种灵敏且准确地鉴定番茄红素的方法就显得尤为重要。液相-质谱(LC-MS)联用检测方法作为一种精确，高效的检测方式结合了色谱强大的分离能力和质谱的灵敏度及准确性，因此能够检测高基质复杂度下的微量成分含量。并且随着相关技术的发展其检测能力也随着时间的推移不断被加强。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、适应于微生物发酵液番茄红素含量的液相-质谱(LC-MS)联用检测方法，以实现通过番茄红素结构中的特征碎片离子进行精准定性，以及利用标品构建的标准曲线进行精准的定量。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了检测微生物发酵液中番茄红素含量的方法，包括如下步骤:1)标准工作溶液配制及检测：称取番茄红素标准品于容量瓶中，使用纯丙酮对番茄红素标准品进行溶解并定容，然后使用纯丙酮通过梯度稀释法逐级稀释成多个浓度梯度的标准工作溶液将不同浓度的标准工作溶液；与流动相A、B液结合一起经流色谱柱进入液相-质谱分析，利用MRM模式进行离子谱图采集从而得到标准谱图。2)根据步骤1)中的获得的标准谱图构建工作溶液浓度与色谱峰面积线性关系曲线图。3)待测样本前处理及检测：将酵母萃取液进行有机过滤膜过滤，过滤完成后所得为待上机检测样本；与流动相A、B液结合一起经流色谱柱进入液相-质谱分析，利用MRM模式进行离子谱图采集从而得到样本谱图。4)待测样本中番茄红素的定量分析：通过步骤3)中获得的样本谱图的保留时间确定番茄红素的色谱峰，并将番茄红素的色谱峰面积与步骤2)中的标准工作溶液的浓度和色谱峰面积线性关系曲线图进行比对，通过外标法确定样品溶液中的番茄红素含量。根据本专利技术，步骤1)所述流动相A液为含1‰甲酸溶液的水溶液。根据本专利技术，步骤1)所述流动相B液为含1‰甲酸溶液的甲酸-乙腈溶液。根据本专利技术，步骤3)所述萃取液为石油醚丙酮溶液(1:10)。第二方面，本专利技术还提供了番茄红素溶液液相色谱的梯度洗脱方法，所述方法包括：在超高效液相色谱仪中，含有番茄红素的待测样品溶液在ACQUITYBEHC18色谱柱上进行分离。流动相A为含1‰甲酸的水溶液(体积百分比)，流动相B为含1‰甲酸的甲酸-乙腈(1:1)溶液(体积百分比)，采用梯度洗脱方式进行洗脱。仪器具体参数设置为：进样量为5μL，流速为0.5mL/min，柱温箱温度设置为45℃，采用表1所示的待测样品溶液中液相色谱洗脱梯度进行洗脱，即采用0.5ml/min的流速，在0、1、1.1、5、5.1、6的时间点，分别使用流动相A(％)的量为：15、15、0、0、15、15，流动相B(％)的量为：85、85、100、100、85、85。表1：待测样品溶液中液相色谱洗脱梯度Time(min)Flow(ml/min)A(％)B(％)00.5158510.515851.10.5010050.501005.10.5158560.51585第三方面，本专利技术还提供了串联质谱检测中MRM模式下番茄红素特征离子对Q1/Q3，所述番茄红素特征离子对Q1/Q3如表2所示,本专利技术中用于番茄红素检测的特征离子对分别为537/467.6和537/455.4，其能在去蔟电压(DP)为94-119v及碎裂电压为22-35v的范围中具有良好的信号响应。表2：MRM模式下待测样品溶液中番茄红素特征离子对Q1Q3DP(volts)CE(volts)537467.6(定量离子)94-11922-35537455.494-11922-35根据本专利技术，其中，Q1为母离子分子质量；Q3为碎裂后子离子分子质量；所述番茄红素特征离子对Q1/Q3的值分别为537/467.6和/或537/455.4。第四方面，本专利技术还提供了串联质谱对番茄红素进行定性和定量的方法，所述方法包括：通过梯度洗脱后的样本进入到串联质谱中进行信号采集并分析番茄红素含量。串联质谱采用电喷雾离子源(ESI)、离子模式采用正离子(postive)模式、采集方式采取选择反应检测模式(MRM)进行。源气参数设置为：喷雾电压设置为5500V；气帘气(CUR)设置为20psi、雾化气(GS1)设置为40psi、辅助气(GS2)设置为40psi。气体性质均为高纯度氮气；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种番茄红素含量的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括：/n(1)待测样本溶液准备；/n(2)液相色谱分离：在超高效液相色谱仪中，样本溶液与流动相A、B液在色谱柱上进行分离，采用梯度洗脱方式进行洗脱；/n(3)串联质谱检测：通过梯度洗脱后的样本进入到串联质谱中，利用MRM模式进行离子谱图采集从而得到样本谱图；/n(4)待测样本中番茄红素含量的确定：通过步骤(3)中获得的样本谱图的保留时间确定番茄红素的色谱峰，并将所述番茄红素的色谱峰面积与标准曲线图进行比对，通过外标法确定样品溶液中的番茄红素含量，其中，所述标准曲线图为不同浓度的标准品溶液的响应值确定的色谱峰面积与对应的番茄红素浓度形成的线性关系图。/n

【技术特征摘要】
1.一种番茄红素含量的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括：
(1)待测样本溶液准备；
(2)液相色谱分离：在超高效液相色谱仪中，样本溶液与流动相A、B液在色谱柱上进行分离，采用梯度洗脱方式进行洗脱；
(3)串联质谱检测：通过梯度洗脱后的样本进入到串联质谱中，利用MRM模式进行离子谱图采集从而得到样本谱图；
(4)待测样本中番茄红素含量的确定：通过步骤(3)中获得的样本谱图的保留时间确定番茄红素的色谱峰，并将所述番茄红素的色谱峰面积与标准曲线图进行比对，通过外标法确定样品溶液中的番茄红素含量，其中，所述标准曲线图为不同浓度的标准品溶液的响应值确定的色谱峰面积与对应的番茄红素浓度形成的线性关系图。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样本为生产番茄红素的微生物和/或其发酵液；
优选地，所述生产番茄红素的微生物和/或其发酵液为生产番茄红素的酵母和/或其发酵液。


3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：将酵母及其发酵液加入离心管中进行超声破碎，加入萃取液，涡旋震荡，萃取；离心并取上清液，上清液通过有机相滤膜过滤，得到待检测番茄红素含量的样本溶液；
优选地，所述超声破碎的功率为100W，所述超声破碎的温度为15-25℃，所述超声破碎的时间为3-5min；优选地，所述萃取液为石油醚丙酮溶液(1:10)，所述萃取液的加入量为0.7-1.3mL，所述涡旋震荡的时间为4-6min，所述萃取的时间为8-15min；优选地，所述离心温度为4℃，所述离心转速为13000rpm，所述离心时间为15-30min；优选地，有机相滤膜的孔径为0.15-0.25μm。


4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述色谱柱为ACQUITYBEHC18色谱柱；
优选地，流动相A液为含1‰甲酸的水溶液(体积百分比)，流动相B液为含1‰甲酸的甲酸-乙腈(1:1)溶液(体积百分比)；
优选地，所述超高效液相色谱仪的具体参数设置为：进样量为5μL，流速为0.5mL/min，柱温箱温度设置为45℃；
优选地，所述梯度洗脱方式为采用如下所示的待测样品溶液中液相色谱洗脱梯度进行洗脱：采用0.5ml/min的流速，在0、1、1.1、5、5.1、6的时间点，分别使用流动相A(％)的量为：15、15、0、0、15、15，流动相B(％)的量为：85、85、100、100、85、85。


5.根据权利要求1-4任一项所述的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：丑天胜，柯酩，任艳，吴志峰，黄俊民，刘斯奇，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44