一株屎肠球菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株屎肠球菌及其应用，本发明专利技术提供的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01，其保藏编号为CGMCC NO.18925为革兰氏染色阳性菌，其对革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑菌能力，并能有效黏附于动物肠道上，将屎肠球菌AH01制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠。

【技术实现步骤摘要】
一株屎肠球菌及其应用
本专利技术属于微生物学领域，具体地说，涉及一株具有抑菌能力，黏附能力的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)及其应用。
技术介绍
乳酸菌是一类在人和动物中广泛存在且具有较大益生作用的革兰氏阳性细菌的总称，是益生菌中最具代表性的菌属。屎肠球菌是乳酸菌中的一种，具有耐酸、耐热等特点。屎肠球菌进入动物肠道后，主要通过以下三个途径对宿主产生作用：(1)黏附肠道黏膜，通过排阻效应抑制病原菌在肠道的黏附，从而保护肠道屏障，维持肠道微生态平衡；(2)代谢产物，通过乳酸、过氧化氢等代谢产物的产生，降低肠道pH，抑制病原菌繁殖；(3)诱导机体产生细胞因子、干扰素、白介素等，增强机体非特异性免疫、提高抗病能力，促进肠道健康。益生菌具有改善肠道健康的益生性能，在养殖业中应用已经日渐广泛，可作为抗生素促生长的潜在替代物，益生菌饲喂后，通过胃肠到达作用部位的活菌数量直接影响其益生效果，而由宿主肝脏分泌、促进脂肪代谢的胆盐是细菌在胃肠道中必须面临的抑菌物质之一，因此胆盐耐受是益生菌在肠道中发挥益生作用的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有抑菌能力，黏附能力的屎肠球菌及其应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)是从中国农业大学肉牛养殖基地的肉牛瘤胃液中筛选并经过紫外光诱变得到，命名为AH01。经16SRNA基因序列分析，该菌株AH01为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。该菌株已于2019年11月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为屎肠球菌Enterococcusfaecium，保藏号为CGMCCNo.18925。屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为球状，直径不超过0.6-0.8μm，无芽胞，无鞭毛；单菌落大小为0.5-1mm，颜色呈灰白色，不透明，菌落表面光滑，边缘规则。菌体分别在pH值2.0、60℃水浴、0.3％胆盐、1.2％胃蛋白酶处理2h后存活率均大于50％。本专利技术提供含有该屎肠球菌AH01的菌剂。本专利技术还提供一种含有该屎肠球菌AH01的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有的屎肠球菌AH01活菌数为6×108CFU/g～1×109CFU/g。本专利技术还提供一种含有该屎肠球菌AH01的动物饲料。其中，所述动物饲料中屎肠球菌AH01的活菌数为1×106CFU/kg～1×109CFU/kg，优选1×107CFU/kg～1×108CFU/kg。本专利技术通过体外法鉴定了屎肠球菌AH01的益生效果，结果表明，屎肠球菌AH01能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。基于屎肠球菌AH01具有的突出的抑菌特性，含有屎肠球菌AH01的药物，特别是抑菌类药物属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01或其发酵产物在制备抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌药物中的应用。优选地，所述药物为抑制金黄色葡萄球菌、和/或抑制沙门氏菌的药物。本专利技术提供了屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01或其发酵产物在制备益生菌剂、饲料添加剂或食品添加剂中的应用。在本专利技术的实施例中，显示了屎肠球菌AH01对金黄色葡萄球菌具有很强的抑制能力，最小半数致死量为1×1011CFU/g。本专利技术的有益效果在于，本专利技术提供了一株具有益生特性的屎肠球菌AH01，该菌对革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑菌能力，对多数常用抗生素均有较好的耐药性，并能有效黏附于动物肠道上，粘附率达78.4％，本专利技术采用酸碱滴定法检测了屎肠球菌AH01总产酸量可达73g/L，表现出优异的益生性能。将本专利技术的屎肠球菌AH01制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠。附图说明图1为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01CGMCCNo.18925的菌落形态图。图2为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01CGMCCNo.18925的革兰氏染色图。图3为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01CGMCCNo.18925的系统发育树。图4为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01CGMCCNo.18925的生长曲线。图5为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01CGMCCNo.18925的产酸性检测结果。图6为实施例6中屎肠球菌AH01的黏附情况示意图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，将pH调至6.2-6.4。实施例1屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01的分离与鉴定1.菌株的分离培养取1ml中国农业大学肉牛养殖基地的肉牛瘤胃液装入有9ml生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1：10稀释液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1ml涂布于LB培养基上。37℃培养48-72小时，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。2.菌株的紫外诱变与初筛将灭菌后的MRS培养基倒入培养皿中，待凝固后取步骤1所得的菌悬液涂布于平板上，每个培养皿控制菌落在50个左右，培养12小时后，距离紫外灯20cm，诱变30s。挑取诱变后的菌株，接种于pH为2的MRS液体培养基中，培养2小时，测定OD值，选取活菌率大于50％的菌株；取适量的菌悬液至于60℃的MRS培养基中，培养2小时，选取活菌率大于50％的菌株；取适量菌悬液至于含有0.3％胆盐的MRS液体培养基中，培养2小时，选取活菌率大于50％的菌株；取适量菌悬液至于含有1.2％胃蛋白酶的MRS液体培养基中，培养2小时，选取活菌率大于50％的菌株。将菌悬液涂布于MRS固体培养基上，培养48小时，挑取单菌落于MRS液体培养基中培养24小时候，取适量菌悬液于Caco-2细胞共培养，选取黏附率大于10％的菌落进行下一步革兰氏染色。3.菌株的革兰氏染色在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个初筛后的单菌落(菌落形态图见图1)在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗，自然晾干；滴加碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01，保藏编号为CGMCC NO.18925。/n

【技术特征摘要】
1.屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01，保藏编号为CGMCCNO.18925。


2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01或其发酵产物。


3.一种食品或饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01或其发酵产物。


4.含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01或其发酵产物的动物饲料。


5.含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)AH01或其发酵产物的抗菌药物。


6.权利要求1所述的屎...

【专利技术属性】
技术研发人员：马曦，姬琳堡，孙美鸽，张中岳，罗小华，王贤锋，陈柱生，
申请(专利权)人：江苏澳华生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32