一种拟微绿球藻的保存方法技术

本发明专利技术公开了一种拟微绿球藻的保存方法，包括以下步骤：将拟微绿球藻与蔗糖混合制成蔗糖藻液；而后将蔗糖藻液与二甲基亚砜混合，得混合藻液；再将混合藻液进行冷冻保存。本发明专利技术通过采用蔗糖和DMSO，可对拟微绿球藻起到保护作用，使拟微绿球藻经长时间存放仍具有高活性，存活率高，总脂肪酸含量稳定，且操作简单，对设备要求低，原料易得，成本低廉。

【技术实现步骤摘要】
一种拟微绿球藻的保存方法
本专利技术涉及微藻藻种保存
，尤其是涉及一种拟微绿球藻的保存方法。
技术介绍
微藻是自然界中广泛分布、个体微小、种类繁多、繁殖快速、光合效率高的一类自养型微生物，因其所具有的独特优势而被视为新一代能够取代化石能源的绿色可再生生物能源。同时，微藻作为水域生态系统的初级生产者，具有合成多不饱和脂肪酸(PUFAs)的能力，PUFAs对于生物体具有重要的生理调节功能，在营养强化、预防和治疗多种疾病有明显疗效。微藻以生长快、PUFAs富集浓度高、提取简单、可直接食用等优点，成为当今开发和利用的资源之一。拟微绿球藻(Nannochloropsissp.)是微藻的一种，它是单细胞真胞藻，属真眼点藻纲，长2～5μm，广泛分布于海水中。它不仅被广泛用于水产动物的饵料，还是许多高附加值产品的重要来源，如蛋白、色素、多不饱和脂肪酸等，是一个具有较高经济价值的海洋藻种，也是进行遗传育种改造的良好材料。目前，在拟微绿球藻的培养和应用中，保种技术十分重要，它是拟微绿球藻培养和进一步应用的基础和关键环节。由于藻种极易受污染，分离培养方法比较复杂而且耗时较长，因此，在拟微绿球藻保种工作中要尽量减少接种次数，避免藻种被杂藻、细菌或原生动物污染，以在达到长期贮藏藻种的目的的同时，需维持藻种的活性。目前，拟微绿球藻的保存方法有：1、继代法保存法，此方法简单易行，但是保存时间短，而且继代频繁，容易发生污染和变异。2、固定化保存法，此方法程序较复杂，大多数的拟微绿球藻在培养后期常会从固定化胶珠中溢出。3、冷冻真空干燥保存法，此方法操作繁琐、对设备要求高等。因此，需要开发一种简单、高效的拟微绿球藻保存方法。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种拟微绿球藻的保存方法。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一方面，提供一种拟微绿球藻的保存方法，包括以下步骤：S1、将拟微绿球藻与蔗糖混合制得蔗糖藻液；而后将所述蔗糖藻液与二甲基亚砜(DMSO)混合，得混合藻液；S2、将所述混合藻液进行冷冻保存。根据本专利技术的一些实施例，步骤S1中，所述蔗糖藻液中蔗糖的体积浓度为15％～25％。根据本专利技术的一些实施例，所述蔗糖藻液中蔗糖的体积浓度为20％。根据本专利技术的一些实施例，步骤S1中，所述混合藻液中二甲基亚砜的体积浓度为5％～20％。根据本专利技术的一些实施例，所述混合藻液中二甲基亚砜的体积浓度为10％。根据本专利技术的一些实施例，步骤S2中，所述冷冻保存的保存温度为-80℃。根据本专利技术的一些实施例，步骤S2具体包括：将所述混合藻液装入冷冻管中，而后将所述冷冻管的管口密封，置于装有异丙醇的程序降温盒中，于-80℃冷冻保存。根据本专利技术的一些实施例，步骤S1之前还包括：步骤S0、将拟微绿球藻培养至指数生长期后期或稳定期。根据本专利技术的一些实施例，步骤S0具体包括：将拟微绿球藻接种到灭菌后的培养基上，置于无菌室中，先在25±1℃、光强为3000lux、光暗比为14h:10h条件下光照培养至指数生长期中期；而后将培养温度调至17±1℃，在光强为3000lux、光暗比为14h:10h条件下培养至指数生长期后期或稳定期。根据本专利技术的一些实施例，所述培养基为MASM微藻人工海水培养基。本专利技术实施例的有益效果是：本专利技术实施例提供了一种拟微绿球藻的保存方法，其中，采用蔗糖与拟微绿球藻混合成蔗糖藻液，藻细胞所处蔗糖溶液环境可以限制水分过快进入藻细胞，为藻细胞提供一个高渗环境，增加抗动力的同时又充分脱水，避免冻存时冰晶形成造成伤害，也避免解冻时发生渗透性休克，起到特异性保护作用；另外，通过添加二甲基亚砜(DMSO)，DMSO的高度水溶性使其易于透过细胞膜并形成高渗透压，可补偿细胞内外存在的盐梯度，进而可防止细胞内的冰晶形成和细胞膜的破坏。由上，通过蔗糖和DMSO的添加，可对拟微绿球藻起到保护作用，使拟微绿球藻经长时间存放仍具有高活性，存活率率高，总脂肪酸含量稳定；且操作简单，对设备要求低，原料易得，成本低廉。附图说明图1是藻细胞密度与细胞光密度之间的关系曲线图；图2是培养温度对拟微绿球藻保存效果的影响实验结果；图3是拟微绿球藻的生长曲线；图4是藻龄对拟微绿球藻保存效果的影响实验结果；图5是蔗糖浓度对拟微绿球藻保存效果的影响实验结果；图6是DMSO浓度对拟微绿球藻保存效果的影响实验结果。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。本专利技术意在提出一种拟微绿球藻的保存方法，而藻细胞复苏率、存活率和总脂肪酸含量可作为拟微绿球藻保存效果的重要衡量指标，因此，研究过程中可通过以上指标的测定考察拟微绿球藻的保存效果。因为拟微绿球藻在682nm处有最大吸收值，因而拟采用酶标仪在682nm处测定藻细胞浓度，进而专利技术人通过确定细胞计数与细胞光密度值(OD682值)的关系对该测定方法进行了验证，具体地：将拟微绿球藻接种于1.2LMASM微藻人工海水培养基中，接种比例为1:9，在25±1℃、光强为3000lux、光暗比为14h:10h条件下通气培养12天；而后向藻液中加入MASM改良液体培养基进行梯度稀释，直至细胞密度约为30万/mL。使用酶标仪测量每个稀释浓度下对应的藻液细胞的吸光度值，每组做2个平行。绘制藻细胞密度与细胞光密度之间的关系曲线，结果如图1所示。从图1可以看出，在细胞密度为90万/mL～4600万/mL的范围内，细胞密度与光密度值(OD682值)呈良好的线性对应关系，相关系数R2＝0.9986。因此，培养拟微绿球藻时，可以用细胞的光密度值来反映细胞的密度。具体可采用酶标仪在682nm处测定藻液的光密度，根据预先确定的藻细胞密度和光密度值(OD682)的关系方程，推算出藻细胞浓度。拟微绿球藻复苏率的测定和计算：依照Canavate的方法,将低温保存试验藻种(试验组)及未经处理的藻种(对照组)移入25mL的培养瓶中,加MASM培养基使最终体积为25mL，置于光照培养箱中培养,温度25±1℃,光照强度3000lux，光暗比为14h:10h，培养期间每天适当摇瓶振荡，培养5天后，测定试验组和对照组的藻细胞密度,两者的百分比值即为超低温保存的复苏率。拟微绿球藻存活率的计算公式：存活率＝保存后存活藻细胞数量/保存前的初始藻细胞数量×100％＝(保存后藻细胞密度*藻液体积)/(初始藻密度*初始体积)×100％；当保存后藻液体积与初始体积相等时，存活率＝保存后藻细胞密度/初始藻密度×100％。总脂肪酸含量的测定方法可参考《GB5009.168食品中脂肪酸的检测》。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、将拟微绿球藻与蔗糖混合制成蔗糖藻液；而后将所述蔗糖藻液与二甲基亚砜混合，得混合藻液；/nS2、将所述混合藻液进行冷冻保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将拟微绿球藻与蔗糖混合制成蔗糖藻液；而后将所述蔗糖藻液与二甲基亚砜混合，得混合藻液；
S2、将所述混合藻液进行冷冻保存。


2.根据权利要求1所述的拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，步骤S1中，所述蔗糖藻液中蔗糖的体积浓度为15％～25％。


3.根据权利要求2所述的拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，所述蔗糖藻液中蔗糖的体积浓度为20％。


4.根据权利要求1所述的拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，步骤S1中，所述混合藻液中二甲基亚砜的体积浓度为5％～20％。


5.根据权利要求4所述的拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，所述混合藻液中二甲基亚砜的体积浓度为10％。


6.根据权利要求1所述的拟微绿球藻的保存方法，其特征在于，步骤S2中，所述冷冻保存的保存温度为-80℃。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦捷，乔瓦尼科利卡，李文香，李林，吴玉双，胡桑，王敬，俞威，
申请(专利权)人：广西小藻农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45