用于油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于油菜Pol‑CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物，包括以下序列的正向引物F和反向引物R：正向引物F：5’‑AGTTAGCTCCTCTGTGGTTTGC‑3’；反向引物R：5’‑CTACAGCTCGATTAGGGATCGT‑3’。具有较强的通用性，在杂交种或其亲本种子纯度鉴定中更具实际意义。还公开了该特异SSR标记引物在判断油菜Pol‑CMS种子育性、油菜Pol‑CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定中的应用，操作简单，鉴定结果准确，具有较强的通用性，可大大简化新品种、新组合的纯度鉴定，为种子研究人员、种子管理和执法部门提供一个新的鉴定技术和方法。

【技术实现步骤摘要】
用于油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物及其应用
本专利技术属于油菜育种
，尤其涉及一种可用于甘蓝型油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物及其应用。
技术介绍
波里马细胞质不育(polimacytoplasmicmalesterility,PolCMS)是第一个具有生产价值的甘蓝型油菜细胞质不育类型，也是目前我国油菜应用范围最广的杂交种授粉控制系统的不育源。该系统不育系不育性受位于线粒体基因组的不育基因与核基因组互作控制，其育性恢复基因(Rfp)位于核基因组。该类型不育系的育性容易受环境温度影响，在大面积杂交制种过程易出现微粉自交结实现象，导致产生母本假杂种。由于母本假杂种为不育株，不仅影响品种的一致性，更严重影响了品种产量优势的发挥，因此在油菜杂交种应用生产之前必须进行严格的种子纯度质量鉴定。目前，油菜纯度质量室内鉴定主要用同工酶电泳、醇溶蛋白电泳和分子标记技术三大类。其中，同工酶电泳和醇溶蛋白电泳具有技术简便、鉴定快速、所需成本低廉等优点，但同工酶和贮藏蛋白多态性相对较低，对于某些杂交组合难以将其亲本与杂交种区分开，该技术的实际应用受到了极大限制。基于基因组DNA序列的分子标记，特别是90年代初期发展起来的SSR标记，其数量极为丰富，多态性高，且相对其他分子标记而言该类型标记操作技术相对简单、成本较低，已成为人们在作物品种纯度和真伪鉴定方面首选的分子标记类型。但随着育种资源遗传多样性日趋狭窄，SSR标记筛选工作量已越来越大。同时，目前育种家在杂交种亲本选育时，往往在表型性状基本一致时，便开始亲本繁殖和杂交制种，而在分子层面上遗传信息仍存在分离现象，在实际生产很容易出现杂交种SSR标记鉴定纯度与田间种植鉴定的育性调查结果不一致的现象，给生产用种带来质量风险。同时，由于目前用于甘蓝型油菜杂交种纯度SSR鉴定的标记，是利用杂交种的父、母本从全基因组数据库筛选获得的标记，需要针对不同杂交组合筛选不同的鉴定标记，因此需要前期合成大量的标记引物序列以供筛选，增加了鉴定的成本和前期投入，不利于技术的普及和应用。同时，针对油菜特定杂交组合筛选的SSR标记，只能用于特定杂交组合的杂合体基因型的检测，而在实际生产中，杂交种生产不仅涉及杂交制种，同时还要开展杂交种亲本种子繁殖。目前，普通SSR标记由于受组合特异性的局限，尚难以利用其检测杂交种亲本种子的纯度质量。因此，普通SSR标记在油菜杂交种纯度鉴定存在通用性差、鉴定结果与田间鉴定易出现偏离的问题，同时不能用于检测杂交种亲本种子纯度，因此开发一种更为有效的基因分型特异SSR标记，对满足杂交种生产质量鉴定的实际生产需要具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种用于油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：一种用于油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物，所述特异SSR标记引物为RfpSSR19，包括以下序列的正向引物F和反向引物R：正向引物F：5’-AGTTAGCTCCTCTGTGGTTTGC-3’(如SEQIDNO.1所示)；反向引物R：5’-CTACAGCTCGATTAGGGATCGT-3’(如SEQIDNO.2所示)。上述的特异SSR标引物记，优选的，所述特异SSR标记引物的扩增位点位于甘蓝型油菜基因组的NC_024803.1:34437588至34437748处。优选的，所述特异SSR标记引物的在甘蓝型油菜Pol-CMS不育系中扩增DNA片段长度为162bp，在恢复系中扩增DNA片段长度为184bp。有研究表明，控制油菜PolCMS育性恢复的为单显基因Rfp。近年来，学者们对该基因做了大量的遗传定位工作，并开发了一系列与育性恢复基因连锁的分子标记，Rfp基因曾先后分别被定为位于N9或N18连锁群上。直到2014年，Rfp被定位在甘蓝型油菜的N9连锁群，并通过分子标记分析将Rfp基因限定在白菜型油菜基因组A9上29.2k的区域。该区域含有7个ORFs，其中ORF2很有可能与育性恢复有关。后来，学者将ORF2在甘蓝型油菜不育系进行遗传转化，结果表明ORF2具有育性恢复的功能，进一步序列分析的结果表明，ORF2的编码区长1953bp。同时，白菜和甘蓝型油菜油菜基因组测序信息分别于2011年和2014年完成数据库公布，也为分子标记开发提供了可利用的参考平台。本专利技术针对目前PolCMS杂交制种和亲本繁殖过程中，杂交种及其亲本纯度质量鉴定的实际生产需求，利用Rfp候选基因区域序列信息，在甘蓝型油菜和白菜基因组进行目标序列BLAST分析，确定与育性恢复相关PPR基因的位置及序列，然后在其附近区域开发SSR标记，并用于PolCMS杂交品种的纯度鉴定研究，以期为油菜杂交种纯度鉴定工作提供更为准确、高效的检测方法。基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的特异SSR标记在判断油菜Pol-CMS种子育性中的应用，其应用方法包括如下步骤：S1、将甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品进行发芽培养，培养得到的幼胚中加NaOH溶液后，置于超声波洗剂器(北京六一仪器厂WD-9415B型)中超声破碎，最后加Tris-HCl溶液，混匀后得到用于PCR扩增的DNA模板混合液；S2、在所述步骤S1得到的DNA模板混合液中加入含有所述特异SSR标记引物RfpSSR19的PCR反应混合液后，再加入矿物油覆盖，进行PCR扩增反应；S3、将所述步骤S2得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，读取凝胶成像结果；若凝胶成像结果仅出现单一的一条长度为162bp的条带，则判断该甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品为不育单株；若凝胶成像结果出现一条长度为184bp的条带，则判断该甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品为正常可育单株。上述的应用，优选的，所述NaOH溶液的加入量为：每个幼胚加40-50μL0.25mol/L的NaOH溶液；所述Tris-HCl溶液的加入量为：每个幼胚加120-150μL0.1mol/L的Tris-HCl溶液；所述PCR反应混合液、矿物油的加入量为：每2-3μL所述步骤S1得到的混合液中加入8-10μLPCR反应混合液，再加入10-20μL矿物油覆盖；所述PCR反应混合液中含有1μL10×Buffer(含Mg2+)，0.2μL10mmol/LdNTP，0.5UTaqDNA聚合酶，以及所述特异SSR标记引物RfpSSR19的正向引物与反向引物各35ng。更优选的，所述发芽培养具体包括如下步骤：将甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品置于平铺吸水纸的发芽盒中，25-28℃发芽培养4-5天，直至胚轴身长2cm以上，且子叶完全变绿；所述超声破碎参数条件为：破碎时间为5-10min，水温控制在70～80℃，功率控制在200～250W；所述电泳分离分离采用的琼脂糖凝胶为质量百分比为3.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物，其特征在于，所述特异SSR标记引物为RfpSSR19，包括以下序列的正向引物F和反向引物R：/n正向引物F：5’-AGTTAGCTCCTCTGTGGTTTGC-3’；/n反向引物R：5’-CTACAGCTCGATTAGGGATCGT-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于油菜Pol-CMS杂交种或其亲本种子纯度鉴定的特异SSR标记引物，其特征在于，所述特异SSR标记引物为RfpSSR19，包括以下序列的正向引物F和反向引物R：
正向引物F：5’-AGTTAGCTCCTCTGTGGTTTGC-3’；
反向引物R：5’-CTACAGCTCGATTAGGGATCGT-3’。


2.根据权利要求1所述的特异SSR标记引物，其特征在于，所述特异SSR标记引物的扩增位点位于甘蓝型油菜基因组的NC_024803.1:34437588至34437748处。


3.根据权利要求1或2所述的特异SSR标记引物，其特征在于，所述特异SSR标记引物的在甘蓝型油菜Pol-CMS不育系中扩增DNA片段长度为162bp，在恢复系中扩增DNA片段长度为184bp。


4.一种如权利要求1-3中任一项所述的特异SSR标记引物在判断油菜Pol-CMS种子育性中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其应用方法包括如下步骤：
S1、将甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品进行发芽培养，培养得到的幼胚中加NaOH溶液后，置于超声波洗剂器中超声破碎，最后加Tris-HCl溶液，混匀后得到用于PCR扩增的DNA模板混合液；
S2、在所述步骤S1得到的DNA模板混合液中加入含有所述特异SSR标记引物RfpSSR19的PCR反应混合液后，再加入矿物油覆盖，进行PCR扩增反应；
S3、将所述步骤S2得到的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，读取凝胶成像结果；若凝胶成像结果仅出现单一的一条长度为162bp的条带，则判断该甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品为不育单株；若凝胶成像结果出现一条长度为184bp的条带，则判断该甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品为正常可育单株。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述NaOH溶液的加入量为：每个幼胚加40-50μL0.25mol/L的NaOH溶液；所述Tris-HCl溶液的加入量为：每个幼胚加120-150μL0.1mol/L的Tris-HCl溶液；
所述PCR反应混合液、矿物油的加入量为：每2-3μL所述步骤S1得到的混合液中加入8-10μLPCR反应混合液，再加入10-20μL矿物油覆盖；所述PCR反应混合液中含有1μL10×Buffer，0.2μL10mmol/LdNTP，0.5UTaqDNA聚合酶，以及所述特异SSR标记引物RfpSSR19的正向引物与反向引物各35ng。


7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述发芽培养具体包括如下步骤：将甘蓝型油菜Pol-CMS种子样品置于平铺吸水纸的发芽盒中，25-28℃发芽培养4-5天，直至胚轴身长2cm以上，且子叶完全变绿；所述超声破碎参数条件为：破碎时间为5-10min，水温控制在70～80℃，功率控制在200～250W；所述电泳分离分离采用的琼脂糖凝胶为质量百分比为3.0-3.5％的琼脂糖凝胶，电泳电压为120-150V稳压。


8.一种如权利要求1-3中任一项所述的特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王同华，李莓，郭一鸣，李宝，刘新红，曲亮，范连益，
申请(专利权)人：湖南省作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43