一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法技术

本发明专利技术涉及槲皮素生产技术领域，具体公开了一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，其步骤包括：材料预处理、分离组织块、内生真菌抑菌试验测定、菌株液体发酵、产物的提取。本发明专利技术采用微生物发酵方法制备槲皮素，与传统的通过豆科植物槐的干燥花蕾提取的方法相比，工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了槲皮素有效成分的原有化学结构和优良药效；同时微生物培养所用的营养基质是工业生产的副产物，既可以使废弃物得到有效利用，又能带来较大的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法
本专利技术涉及槲皮素生产
，具体涉及一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法。
技术介绍
槲皮素(Quercetin)，又名栎精，槲皮黄素，Meletin,Sophretin，槲皮素化学名为3,3′,4,5,7-五羟基黄酮，化学分子式为C15H10O7，相对分子质量为302.24。槲皮素及其衍生物广泛分布于多种植物的叶、花、果实中，多以苷的形式存在，是植物界分布最广的黄酮类化合物，具有多种生物活性和很高的药用价值，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮之一。其二水合物为黄色针状结晶(稀乙醇)，在95-97℃成为无水物，熔点314℃(分解)。能溶于冷乙醇(1:290)，易溶于热乙醇(1:23)，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，溶于冰醋酸及碱性水溶液显黄色等，几乎不溶于水，乙醇溶液味苦。其存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁(芸香甙)，槲皮甙，金丝桃甙等植物中含量较高。其英文名“Quercetin”最早出现在1857年，其来源于“Quercet本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，其特征在于，其步骤如下：/n(1)材料预处理/n选择健康、无病虫害的洋槐树上的刺，用流水洗濯植物材料后用超声波进行处理以清除材料表面的杂物，样品处理好后放在无菌袋中，置于4℃冰箱中备用；/n(2)分离组织块/n在无菌工作台上，将清洗干燥后的洋槐刺进行表面消毒，用灭菌滤纸吸干样品表面多余水分，用无菌工具将材料纵向切割为两份，剪切成0.5cm长的小段，将表面消毒的组织块分别置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、高氏Ⅰ号培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)、水琼脂培养基、改良PDA培养基Ⅰ、改良PDA培养基Ⅱ、改良PDA培养基Ⅲ上，每个培养皿中接4-5个...

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)材料预处理
选择健康、无病虫害的洋槐树上的刺，用流水洗濯植物材料后用超声波进行处理以清除材料表面的杂物，样品处理好后放在无菌袋中，置于4℃冰箱中备用；
(2)分离组织块
在无菌工作台上，将清洗干燥后的洋槐刺进行表面消毒，用灭菌滤纸吸干样品表面多余水分，用无菌工具将材料纵向切割为两份，剪切成0.5cm长的小段，将表面消毒的组织块分别置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、高氏Ⅰ号培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)、水琼脂培养基、改良PDA培养基Ⅰ、改良PDA培养基Ⅱ、改良PDA培养基Ⅲ上，每个培养皿中接4-5个样品，于28℃恒温静置培养4-7d；待培养基中有可见菌落时，取边缘处菌丝，采用尖端菌丝挑取法对所分离的内生真菌进行分离纯化；直至纯种，纯化后转接到PDA斜面上，淘汰重复菌株，编号并保存在4℃冰箱中备用；
设置对照组：
为了确保表面消毒彻底，将最后一次清洗水分别涂布于不同培养基上，在相同条件下进行培养，作为对照；如对照中无菌生长，则说明表面消毒彻底，能够保证分离到的菌是植物内生真菌而不是空气中或植物分离源表面的附着菌；
(3)内生真菌抑菌试验测定
采用平板对峙培养法测定上述分离得到的内生真菌的抑菌活性，无菌条件下，在PDA培养基(20mLPDA/皿)的中间放置一个供试指示菌菌饼，在边缘等距离处移入四块直径为0.5cm的供试内生真菌菌饼(使用无菌打孔器制得)，设单一接种待测菌和单一接种各指示菌的平板作为对照，设计3次重复实验，放置于28℃恒温培养箱中进行培养3～7d，观察各菌株的生长及抑制作用，待病原菌不再扩大时，用游标卡尺(0.02mm)测量实验组病原菌直径d1(mm)，抑菌圈直径d(mm)及对照组病原菌直径d0(mm),并按照以下公式计算抑菌率：抑制率(％)＝(对照组菌落直径d0-实验组菌落直径d1)/对照组菌落直径d0×100％；
所述供试指示菌包括：苹果炭疽病菌(编号：Z-01)、番茄灰霉病菌(编号：Z-02)、玉米弯孢病菌(编号：Z-03)、苹果腐烂病菌(编号：Z-04)、黄瓜枯萎病菌(编号：Z-05)、棉花枯萎病菌(编号：Z-06)、小麦赤霉病菌(编号：Z-07)、稻瘟病菌(编号：Z-08)、玉米大斑病菌(编号：Z-09)、番茄灰霉病菌(编号：Z-10)；
(4)菌株液体发酵
用无菌接种环从步骤2所得斜面中挑取菌丝接种于PDA平板上，进行活化，用直径为0.5cm的打孔器制作菌饼，放入液体PDA培养基中，每瓶放3块，静置，让菌丝进行生长一晚上后，摇床转速180r/min，28℃震荡培养7～9d；另取一个液体PDA培养基设为空白对照组，与菌丝在同等条件下进行发酵培养，得到空白发酵液；发酵结束后，将培养物于4000r/min条件下离心15min，过滤去掉菌丝体，取上清液(即发酵液)保存待用；
所述液体PDA培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然，并预先在115℃条件下灭菌25min后备用；
(5)产物的提取
将发酵液减压浓缩，用石油醚、氯仿、乙醇、乙酸乙酯依次萃取；将萃取物在60℃的条件下减压浓缩，蒸干后得到产物槲皮素；
上述步骤1-5中所用有机试剂均为分析纯标准的试剂。


2.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵技术生产槲皮素的方法，其特征在于，所述步骤2中，表...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓振山，常学军，
申请(专利权)人：延安制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61