本发明专利技术公开了一种斑节对虾PmGFPT2基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。还公开了上述基因或所述基因的编码蛋白在提高斑节对虾耐氨氮方面的应用。以及一种斑节对虾GFPT2基因氨氮相关的SNP位点的筛选方法和上述方法筛选的斑节对虾耐氨氮相关的SNP位点在斑节对虾育种方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种斑节对虾PmGFPT2基因及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种斑节对虾PmGFPT2基因及其应用。
技术介绍
己糖胺通路(HBP)是葡萄糖代谢途径之一，是所有生物普遍存在的代谢途径，葡萄糖进入细胞后，首先转化为6-磷酸葡萄糖(Fru6P)，然后谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphateaminotransferase2,GFPT2)将氨和Fru6P合成为6-磷酸葡糖胺(GlcN6P)，再经由中间代谢环节，最终产物为二磷酸尿嘧啶N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)。GFPT2是氨基己糖生物合成限速酶，也被称为葡糖胺-6-磷酸合成酶(glucosamine-6-phosphatesynthase)，主要参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化，UDP-GlcNAc是细菌和真菌细胞壁的主要成分，是蛋白质糖基化的重要底物，也是几丁质的活性前体，几丁质是节肢动物的表皮和中肠围食膜(PM)的主要成分，是形成哺乳动物的糖蛋白、粘多糖基础，在葡萄糖调节中发挥着重要的作用。与GFPT2作用相反的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(glucosamine-6Pdeaminase)可以催化GlcN6P的分解代谢，在细胞内这两种活动必须分开进行，避免形成无效循环。对谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶的研究热点主要集中在其在Ⅱ型糖尿病和结核病中发挥的作用及将其作为靶标进行抗病新药物的研制。GFPT2的活性增强表达量升高被认为导致高血糖症的原因，乐军等人的研究发现，葡糖胺-6-磷酸合成酶表达量的升高与结核分枝菌耐药性增强显著相关。GFPT2在甲壳动物中的研究很少，而其催化合成6-磷酸葡糖胺的过程中有氨氮的参与，对GFPT2在养殖水环境中氨氮浓度升高条件下是否参与氨氮胁迫应答以及发挥的作用等方面的研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种斑节对虾PmGFPT2基因及其编码蛋白。本专利技术的目的还在于提供上述基因或编码蛋白在提高斑节对虾耐氨氮方面的应用。本专利技术的最后一个目的在于提供一种斑节对虾PmGFPT2基因氨氮相关的SNP位点的筛选方法。本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斑节对虾PmGFPT2基因，所述基因的碱基序列如SEQIDNO：2所示。所述的斑节对虾PmGFPT2基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。所述PmGFPT2基因的cDNA全长为3399bp，包括开放阅读框ORF2097bp，5’端非编码区(UTR)65bp，3’端非编码区(UTR)1237bp，PmGFPT2基因的ORF推测包含698个氨基酸，分子量为78.3101KDa，理论等电点为6.31。所述斑节对虾PmGFPT2基因的克隆方法，包括以下步骤：首先提取斑节对虾不同离体组织的总RNA，合成cDNA第一条链，用做RACE模板，并将斑节对虾不同离体组织的总RNA反转录，用作荧光定量PCR样品；然后根据斑节对虾cDNA文库中的EST序列，设计PmGFPT2基因ORF的引物和RACE引物，即得到斑节对虾PmGFPT2基因的全长。所述PmGFPT2基因ORF的引物包括qPCR引物PmGFPT2和内参引物PmEF-1α，其中所述qPCR引物PmGFPT2包括PmGFPT2-qF和PmGFPT2-qR，其碱基序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，所述内参引物PmEF-1α包括PmEF-1α-qF和PmEF-1α-qR，其碱基序列如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示；所述RACE引物包括PmGFPT2-5’GSP1、PmGFPT2-5’GSP2、PmGFPT2-3’GSP1和PmGFPT2-3’GSP2，其碱基序列分别如SEQIDNO：8～11所示。本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的基因或上述基因的编码蛋白在提高斑节对虾耐氨氮方面的应用。本专利技术的上述最后一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斑节对虾PmGFPT2基因氨氮相关的SNP位点的筛选方法，包括以下步骤：(1)样品选择：选择非洲野生群体，泰国野生群体和中国三亚野生群体作为SNP位点筛选样品，选择耐氨氮极端群体以及氨氮敏感群体作为SNP分型样品，并选取标粗池中混养的各家系幼虾为实验材料，使用不同颜色的荧光在虾尾进行标记以区分各家系；(2)斑节对虾PmGFPT2基因组序列的扩增：通过RACE技术克隆得到的斑节对虾PmGFPT2基因的cDNA，然后使用cDNA序列设计特异性引物，使用特异性引物进行PCR扩增，得到斑节对虾PmGFPT2基因组序列；(3)重测序与SNP位点的初筛：提取非洲野生群体、泰国野生群体、三亚野生群体与耐氨氮极端群体的DNA，采用步骤(2)中的特异性引物使用直接测序法初步筛选PmGFPT2上的SNP位点；(4)斑节对虾PmGFPT2基因的SNP位点的分型：将挑选好的SNP位点使用直接测序法进行SNP位点的分型，分型使用的样品为耐氨氮极端群体以及氨氮敏感群体；(5)PmGFPT2基因组序列的扩增，重测序及SNP位点的分型：以混合的斑节对虾DNA为模板，通过扩增得到PmGFPT2基因组序列，以非洲、泰国、三亚三个野生群体的DNA为模板，通过直接测序法在得到的斑节对虾PmGFPT2基因区域2879bp上共筛选得到12个SNP位点，其中4个SNP位于外显子上，8个位于内含子上；(6)斑节对虾PmGFPT2基因与抗氨氮性状关联分析：在扩增得到的斑节对虾PmGFPT2基因上筛选得到的12个SNP中，选取外显子上的4个SNP位点进行分型，并且在两个耐氨氮极端群体中与耐氨氮性状进行关联分析，结果表明，在SEQIDNO：1所示序列的第1557位存在T-C突变，该突变与耐氨氮相关。其中步骤(1)中所述的特异性引物包括GFPT2-QF1、GFPT2-QR1、GFPT2-HF1和GFPT2-HR1，其碱基序列分别如SEQIDNO：12～15所示。本专利技术的还提供了一种斑节对虾PmGFPT2基因耐氨氮相关的SNP位点在斑节对虾育种方面的应用，所述的SNP位点与斑节对虾耐氨氮相关，与所述斑节对虾PmGFPT2基因紧密连锁，位于SEQIDNO：1所示斑节对虾GFPT2参考基因组的第1557上，该位点突变为T/C，所述应用指采用所述SNP位点筛选在位于斑节对虾PmGFPT2参考基因组第1557的位点上具有T/C的斑节对虾。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术使用RACE技术首次克隆了斑节对虾PmGFPT2基因，对其进行了生物信息学分析和组织表达分析，使用qPCR技术检测了其在96h急性氨氮胁迫后的表达变化趋势，并对其变化规律进行了分析和探讨，通过不同微生物刺激实验分析探讨其在免疫调节过程中发挥的作用，综合验证分析了PmGFPT2基因在氨氮胁迫响应和免疫刺激中的重要作用；(2)本专利技术可以准确地从斑节对虾基因组DNA中，快速克隆获得PmGFPT2基因的全长，通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种斑节对虾PmGFPT2基因，其特征是：所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种斑节对虾PmGFPT2基因，其特征是：所述基因的碱基序列如SEQIDNO：2所示。
2.权利要求1所述的斑节对虾PmGFPT2基因的编码蛋白，其特征是：所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。
3.根据权利要求1所述的斑节对虾PmGFPT2基因，其特征是：所述PmGFPT2基因的cDNA全长为3399bp，包括开放阅读框ORF2097bp，5’端非编码区(UTR)65bp，3’端非编码区(UTR)1237bp，PmGFPT2基因的ORF推测包含698个氨基酸，分子量为78.3101KDa，理论等电点为6.31。
4.权利要求1所述斑节对虾PmGFPT2基因的克隆方法，其特征是包括以下步骤：首先提取斑节对虾不同离体组织的总RNA，合成cDNA第一条链，用做RACE模板，并将斑节对虾不同离体组织的总RNA反转录，用作荧光定量PCR样品；然后根据斑节对虾cDNA文库中的EST序列，设计PmGFPT2基因ORF的引物和RACE引物，即得到斑节对虾PmGFPT2基因的全长。
5.根据权利要求4所述斑节对虾PmGFPT2基因的克隆方法，其特征是：所述PmGFPT2基因ORF的引物包括qPCR引物PmGFPT2和内参引物PmEF-1α，其中所述qPCR引物PmGFPT2包括PmGFPT2-qF和PmGFPT2-qR，其碱基序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，所述内参引物PmEF-1α包括PmEF-1α-qF和PmEF-1α-qR，其碱基序列如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示；所述RACE引物包括PmGFPT2-5’GSP1、PmGFPT2-5’GSP2、PmGFPT2-3’GSP1和PmGFPT2-3’GSP2，其碱基序列分别如SEQIDNO：8～11所示。
6.权利要求1或3所述的基因或权利要求2所述编码蛋白在提高斑节对虾耐氨氮方面的应用。
7.一种斑节对虾PmGFPT2基因氨氮相关的SNP位点的筛选方法，其特征是包括以下步骤：
(1)样品选择：选择非洲野生群体，泰国野生群体和中国三亚野生群体作为SNP位点筛选样品，选择耐氨氮极端群体以及氨氮敏感群体作为SNP分型样品，并选取标...
【专利技术属性】
技术研发人员：李运东，周发林，江世贵，丁阳阳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。