用于生物学表面的紫外激发显微术的方法技术

具有紫外表面激发的显微镜(MUSE)，用于在教室中使用以增强生命科学教育和课程，或用于其它应用，包括但不限于手术室、其它医学环境、研究环境和低资源环境。MUSE的适用性基于多个关键因素，包括其使用的简单性、结合廉价硬件(包括LED照明)、以及非常基本的组织制备。紫外激发作为将所生成的荧光信号限制到组织表面下方仅几微米的无源光学切片，因此消除离焦信号。这促进在完整或切片表面处从试样的组织微观结构和组构的图像捕获，这是由于在不同的细胞隔室内变化的荧光团浓度所引起的。尽管可以仅使用组织自发荧光，但是图像质量通过简单地应用无毒荧光染料以选择性地突出细胞隔室而增强。样品制备是安全、有效的，并且对于具有基本化学或生物学实验室经历的学生是熟悉的。混合染料粉末可用于简化该方法对于教育、医学、研究、低资源和其它环境的转换。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物学表面的紫外激发显微术的方法相关申请本专利申请要求对于“SystemsandMethodsforUltravioletSurfaceExcitationMicroscopy”在2018年1月26日提交的美国临时专利申请序号62/622,358和对于“SystemsandMethodsforUltravioletSurfaceExcitationMicroscopy”在2018年3月14日提交的美国临时专利申请序号62/642,730的优先权和权益，两者的全部内容通过引用并入本文。联邦资金本专利技术是在由能源部授予的DE-NA0001944的政府支持下进行的。政府对本专利技术享有一定权利。相关领域紫外表面激发显微术系统和方法。背景宽视场光学显微术是用于在生物学教育中向学生介绍活体的微观结构的形象工具。由于宽视场光学显微镜的通用性和低价格，它们被广泛地应用于全世界的学校[1]。然而，组织中的光散射使得细胞结构不可能直接成像，因为离焦信号强得多，而细胞隔室之间的图像对比度非常有限。结果，在大学生教育实验室环境中，观察生物学样品通常局限于准备好的微米厚组织样品的载玻片或来自洋葱或面颊刮削的活样品[2]。甚至需要将洋葱皮切成薄的单细胞层，以使特征性的大尺寸细胞结构(如细胞膜和细胞核)可视化，这是在教育环境中学生完成的一项重要任务。因此，学生经常发现显微术实验令人沮丧，导致对探索细胞解剖学的最初实习体验的动机低[2]。例如，与传统的4年设立相比，专注于使更高级教育可进入更广泛的社会范围的社区学院中的学生的体验表明，载玻片制备的挑战使经常离开课程的学生泄气，这可能使他们在更高级课程中失败[3]。心理学家认为，成就动机对于教育是至关重要的；对他/她的学科能力不自信的学生将对相关领域变得不太感兴趣[4]。使用准备好的显微镜载玻片和教科书图像教导学生吸引度较低，并且可能不会刺激他们在生命科学中的兴趣或者他们在相关领域中从事职业的能力的自信。提供光学切片和快速成像组织微观结构的能力的正在开发的成像方法[5-10]对于教室使用是复杂且昂贵的。其它领域也可以从更好的显微术系统和方法中受益。例如，制备用于显微镜检查的样品通常所需的时间、设备、专业人员和(通常有毒的)化学品限制了可以制备和检查样品的地点和时间。例如，在手术室中，人们通常没有时间或能力使用传统的样品制备方法制备用于显微镜检查的样品。低资源环境是另一个实例，其中由于缺乏设备、专业知识、材料、合适的设施和合适的地方来处理有毒化学品和在使用后需要仔细处理的其它材料，传统的病理学方法完全不可能。对于教室、医院、低资源环境、生物医学研究实验室和其它环境，需要更好的显微术系统和方法。概述本文我们探究用于在各种环境中使用的具有紫外表面激发的显微术(MUSE)[11]。MUSE可以产生新鲜组织的近表面层的显微照片，而不需要组织处理成超薄切片，如在常规的H&E染色中使用的。常规的H&E染色切片通常为5-10μm厚。使用MUSE的试样的厚度可以是任意的，通常大约几毫米。小动物(小鼠、青蛙等)的器官小，大约1厘米或更小，并且可以被分成/切割成多个切片以用MUSE对其内部成像。最近在别处已经提出一般MUSE方法的描述，集中于其在医学领域中的潜在实现。简而言之，该研究涉及新鲜的或福尔马林固定的组织，将其短暂地暴露于荧光染料(如罗丹明或DAPI)，所述荧光染料定位在不同的细胞隔室中并在可见光谱范围内发射。随后将试样在盐水中清洗，并放置在宽视场显微镜中，其中组织表面通常在轻微压力下在薄的光学器件上变平，该光学器件在用于激发的光谱范围内是透明的。该激发由在紫外(UV)光谱范围(在一个实例中，在约270nm)中操作的发光二极管(LED)源提供。该激发引起荧光染料的基态电子占据较高的激发态，并最终在较低的激发态中级联，以从每种染料产生典型的可见荧光。因此，一种UV激发波长可用于两种或更多种染料，所述染料可以提供不同细胞组分(通常是细胞质和细胞核)的染色。成像系统可以基于标准显微镜光学器件和单色或彩色电荷耦合装置(CCD)照相机。因为取决于波长，在MUSE中使用的UV光在组织中的穿透深度可以非常浅，大约一个细胞直径[11]，当使用较低放大倍数物镜时，信号可以定位在显微镜的光学器件的成像深度内，并且仍然提供大约1μm或更小的空间分辨率。较低放大倍数标准显微镜物镜以及长工作距离物镜也支持绕过显微镜的光学器件的组织斜角照明。用这种方法产生的人类组织的图像可以类似于常规组织病理学图像，而图像处理可以将彩色图像转换成类似的常规苏木精和曙红(H&E)图像。MUSE在教育、手术室、低资源环境、生物医学研究实验室和其它环境中的适用性源于其简单性，因为它可依赖于廉价的硬件，并且可能需要非常有限的待成像组织制备。可使得MUSE系统和方法进一步适用于这些应用，例如，通过仅使用满足教室和其它通用安全要求的无毒化学品，以及使用可由学生或其它个人容易地执行而无需专门的样品制备训练的组织制备方法。对于教室使用，通常期望该方法可与在高中和大学生教育中通常使用的组织试样一起使用，当多个学生可以共享资源时，该方法可以以及时的方式(例如在课堂期间内)实现，并且所获得的图像和所观察到的结构特征是使用学生可用的信息(书等)可察觉和可识别的。在教育环境下，动物解剖仍然是生命科学教育的重要部分，因为其能够证明生物体的复杂性[12]。学生通常仅研究主要器官结构，并在没有观察组织学的情况下处理试样[1]。MUSE可利用来自当前解剖阶段的试样使器官特异性微观结构可视化。这将扩展学生学习体验，并且与冷库存制备的载玻片相比，更吸引人且更与学生的个人体验相关。鼓励学生将课程材料与个人体验联系起来的教室活动增加了学生的动机和学习，尤其是对成功期望低的学生[13]。此外，MUSE可提供高质量的实习体验，当学生通过探究学习时，该体验可正面地影响学生的兴趣[14]。MUSE也将通过提供来自动物试样的更多信息来帮助改进动物试样效率，并因此满足实验动物使用的3-R(替代、减少和优化)原则[15]。在一个实例中，显微术方法利用紫外表面激发显微术系统与混合荧光染料溶液的组合，所述混合荧光染料溶液由一组预选比例的发荧光染色剂制成，用于当溶解于预选体积的溶剂中时产生所述混合荧光染料溶液，所述方法包括：(a)将用于显微镜分析的样品暴露于所述混合荧光染料溶液达预定的时间段，使所述样品的特征染色，所述溶液至少包括第一浓度的第一发荧光染色剂和第二浓度的第二发荧光染色剂，所述第一发荧光染色剂的特征在于当经受所述显微术系统的第一波长的紫外光时的第一光发射光谱，所述第二荧光染料的特征在于当经受所述显微术系统的所述第一波长的紫外光时的第二光发射光谱，所述第一发射光谱不同于所述第二发射光谱；(b)定位所述样品用于通过所述显微镜成像，所述显微镜包括紫外光源和显微镜物镜；(c)使用所述紫外光源同时激发与所述样品的所述特征相关联的所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色剂，使得所述显微镜物镜收集来自所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.使样品染色用于通过紫外表面激发显微术系统检查的方法，所述方法包括：/n(a)选择由一组预选比例的发荧光染色剂制成的混合荧光染料溶液，用于当溶解于预选体积的溶剂中时产生所述混合荧光染料溶液，所述溶液包含：/n(i)至少以下发荧光染色剂：第一浓度的第一发荧光染色剂和第二浓度的第二发荧光染色剂，/n(ii)所述第一发荧光染色剂的特征在于当通过所述紫外表面激发显微术系统经受第一波长的紫外光时的第一光发射光谱，所述第二发荧光染色剂的特征在于当经受所述第一紫外光源波长时的第二光发射光谱，其中所述第一发射光谱不同于所述第二发射光谱；和/n(b)将用于紫外表面激发显微术检查的样品暴露于所述混合荧光染料溶液达预定的时间段，以使所述样品的特征染色；/n其中所述所选的混合荧光染料溶液被配置成制备所述样品，用于在所述第一紫外光源波长下通过所述紫外表面激发显微术系统成像，使得与所述第一发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统在第一强度下成像，并且与所述第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统在第二强度下成像，其中所述第一强度和第二强度大致相同。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180126 US 62/622358;20180314 US 62/6427301.使样品染色用于通过紫外表面激发显微术系统检查的方法，所述方法包括：
(a)选择由一组预选比例的发荧光染色剂制成的混合荧光染料溶液，用于当溶解于预选体积的溶剂中时产生所述混合荧光染料溶液，所述溶液包含：
(i)至少以下发荧光染色剂：第一浓度的第一发荧光染色剂和第二浓度的第二发荧光染色剂，
(ii)所述第一发荧光染色剂的特征在于当通过所述紫外表面激发显微术系统经受第一波长的紫外光时的第一光发射光谱，所述第二发荧光染色剂的特征在于当经受所述第一紫外光源波长时的第二光发射光谱，其中所述第一发射光谱不同于所述第二发射光谱；和
(b)将用于紫外表面激发显微术检查的样品暴露于所述混合荧光染料溶液达预定的时间段，以使所述样品的特征染色；
其中所述所选的混合荧光染料溶液被配置成制备所述样品，用于在所述第一紫外光源波长下通过所述紫外表面激发显微术系统成像，使得与所述第一发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统在第一强度下成像，并且与所述第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统在第二强度下成像，其中所述第一强度和第二强度大致相同。


2.权利要求1所述的方法，其中所述所选的混合荧光染料溶液被配置成制备所述样品，用于通过所述紫外表面激发显微术系统成像，所述紫外表面激发显微术系统包含多通道传感器以检测通过显微镜物镜收集的所述光发射，其中所述多通道传感器的第一通道对所述第一发荧光染色剂光发射光谱比对所述第二发荧光染色剂光发射光谱更敏感，其中所述多通道传感器的第二通道对所述第二发荧光染色剂光发射光谱比对所述第一发荧光染色剂光发射光谱更敏感。


3.权利要求1所述的方法，其中所述溶剂是水基流体。


4.权利要求2所述的方法，其中所述第一强度和第二强度大致相同包括与所述第一发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射的平均强度在与所述第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射的平均强度的1/3-3倍范围内。


5.权利要求4所述的方法，其中所述第一染色剂浓度和第二染色剂浓度以及所述预定的时间段被配置成使得通过所述多通道传感器的所述第一通道记录的所述第一光发射强度与通过所述多通道传感器的所述第二通道记录的第二光发射强度大致相同。


6.权利要求4所述的方法，其中所述第一染色剂浓度和第二染色剂浓度、所述预定的时间段以及所述紫外光源波长和强度被配置成使得通过所述多通道传感器的所述第一通道记录的所述第一发荧光染色剂光发射强度与通过所述多通道传感器的所述第二通道记录的第二发荧光染色剂光发射强度大致相同。


7.权利要求6所述的方法，其中所述第一染色剂浓度和第二染色剂浓度、所述预定的时间段以及所述紫外光源的波长发射光谱被配置成使得通过所述多通道传感器的所述第一通道记录的所述第一光发射强度与通过所述多通道传感器的所述第二通道记录的第二光发射强度大致相同。


8.权利要求3所述的方法，其中所述预选比例的发荧光染色剂的组包含粉末形式并且被配置成使不同的细胞隔室染色。


9.权利要求8所述的方法，其中所述预选比例的发荧光染色剂的组包含粉末形式的曙红染料和粉末形式的Hoechst染料，其中以重量计，所述曙红染料的量在所述Hoechst染料的量的约1-10倍范围内。


10.权利要求9所述的方法，其中所述显微术系统的所述第一紫外光源波长包含260nm至280nm范围内的紫外光。


11.权利要求9所述的方法，其中所述显微术系统的所述第一紫外光源波长包含230nm至370nm范围内的紫外光。


12.权利要求9所述的方法，其中所述显微术系统的所述第一紫外光源波长包含250nm至290nm范围内的紫外光。


13.权利要求1所述的方法，其中所述所选的混合荧光染料溶液被配置成使所述样品染色，用于在所述紫外表面激发显微术系统的所述第一波长下通过所述显微术系统成像，使得与所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统以每个像素大于约50个计数的图像强度成像。


14.权利要求13所述的方法，其中所述所选的混合荧光染料溶液被配置成使所述样品染色，用于在所述显微术系统的所述第一波长下通过所述紫外表面激发显微术系统成像，使得与所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统以相对于所述特征的相应的自发荧光强度的至少1.2倍的图像强度成像。


15.权利要求14所述的方法，其中所述所选的混合荧光染料溶液被配置成制备所述样品，用于在所述紫外表面激发显微术系统的所述第一紫外光源波长下通过所述显微术系统成像，使得与所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射在没有显著存在图像伪影的情况下通过所述系统成像。


16.显微术方法，其利用紫外表面激发显微术系统与混合荧光染料溶液的组合，所述混合荧光染料溶液由一组预选比例的发荧光染色剂制成，用于当溶解于预选体积的溶剂中时产生所述混合荧光染料溶液，所述方法包括：
(a)将用于显微镜分析的样品暴露于所述混合荧光染料溶液达预定的时间段，使所述样品的特征染色，所述溶液至少包含第一浓度的第一发荧光染色剂和第二浓度的第二发荧光染色剂，所述第一发荧光染色剂的特征在于当经受所述显微术系统的第一波长的紫外光时的第一光发射光谱，所述第二荧光染料的特征在于当经受所述显微术系统的所述第一波长的紫外光时的第二光发射光谱，其中所述第一发射光谱不同于所述第二发射光谱；
(b)定位所述样品用于通过所述显微镜成像，所述显微镜包含紫外光源和显微镜物镜；
(c)使用所述紫外光源同时激发与所述样品的所述特征相关联的所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色剂，使得所述显微镜物镜收集来自所述第一发荧光染色剂和第二发荧光染色剂的光发射；
(d)其中所述方法被配置成使得与所述第一发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统在第一强度下成像，并且与所述第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射通过所述系统在第二强度下成像，其中所述第一强度和第二强度大致相同。


17.权利要求16所述的显微术方法，所述方法进一步包括使用多通道传感器以检测通过所述显微镜物镜收集的所述光发射，其中所述多通道传感器的第一通道对所述第一光发射光谱比对所述第二光发射光谱更敏感，其中所述多通道传感器的第二通道对所述第二光发射光谱比对所述第一光发射光谱更敏感。


18.权利要求16所述的显微术方法，其中所述溶剂是水基流体。


19.权利要求17所述的显微术方法，其中所述第一强度和第二强度大致相同包括与所述第一发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射的平均强度在与所述第二发荧光染色剂相关联的特征的所述光发射的平均强度的1/3-3倍范围内。


20.权利要求19所述的显微术方法，其中所述第一染色剂浓度和第二染色剂浓度以及所述预定的时间段被配置成使得通过所述多通道传感器的所述第一通道记录的所述第一光发射强度与通过所述多通道传感器的所述第二通道记录的第二光发射强度大致相同。

...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·G·德莫斯，C·黄，
申请(专利权)人：罗切斯特大学，
类型：发明
国别省市：美国;US