【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于恢复F8基因功能的腺相关病毒组合物和其使用方法相关申请本申请要求于2018年2月19日提交的第62/632,300号美国临时专利申请、2018年2月20日提交的第62/639,919号美国临时专利申请和2018年5月16日提交的第62/672,385号美国临时专利申请的优先权，其全部公开在此以引用的方式并入本文中。以电子方式提交的序列表的参考ASCII文本文件(名称：610416_HMT-026PC_SeqList_ST25.txt；大小：156,992字节；和创建日期：2019年2月10日)中以电子方式提交的序列表的内容以全文引用的方式并入本文中。政府权益声明本专利技术是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号P30CA033572下进行。政府在本专利技术中享有一定权利。
技术介绍
VIII因子(FactorVIII；FVIII)，也称为抗血友病因子，是一种对正常凝血很重要的循环糖蛋白。VIII因子是由肝窦内皮细胞和肝外内皮细胞产生的。这种...
【技术保护点】
1.一种用于校正细胞中的F8基因中的突变的方法，所述方法包括用复制缺陷型腺相关病毒(adeno-associated virus；AAV)转导所述细胞，所述腺相关病毒包括：/na)AAV衣壳；和/nb)校正基因组，其包括：(i)用于编辑所述F8基因中的靶基因座的编辑元件；(ii)所述编辑元件5'的5'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座5'的第一基因组区域具有同源性；和(iii)所述编辑元件3'的3'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座3'的第二基因组区域具有同源性，/n其中转导所述细胞而无需共转导或共施用外源性核酸酶或编码外源性核酸酶的核苷酸序列。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180219 US 62/632,300;20180220 US 62/632,919;20181.一种用于校正细胞中的F8基因中的突变的方法，所述方法包括用复制缺陷型腺相关病毒(adeno-associatedvirus；AAV)转导所述细胞，所述腺相关病毒包括：
a)AAV衣壳；和
b)校正基因组，其包括：(i)用于编辑所述F8基因中的靶基因座的编辑元件；(ii)所述编辑元件5'的5'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座5'的第一基因组区域具有同源性；和(iii)所述编辑元件3'的3'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座3'的第二基因组区域具有同源性，
其中转导所述细胞而无需共转导或共施用外源性核酸酶或编码外源性核酸酶的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是肝细胞或内皮细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述内皮细胞是肝窦内皮细胞。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述细胞是在哺乳动物受试者中，且以有效转导所述受试者中的所述细胞的量向所述受试者施用所述AAV。
5.一种用于治疗患有与F8基因突变相关联的疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复制缺陷型AAV，所述AAV包括：
a)AAV衣壳；和
b)校正基因组，其包括：(i)用于编辑所述F8基因中的靶基因座的编辑元件；(ii)所述编辑元件5'的5'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座5'的第一基因组区域具有同源性；和(iii)所述编辑元件3'的3'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座3'的第二基因组区域具有同源性，
其中未向所述受试者共施用外源性核酸酶或编码外源性核酸酶的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述疾病或病症是血友病A。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述编辑元件包括F8编码序列的一部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述F8编码序列的所述部分编码SEQIDNO:25中所阐述的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述F8编码序列的所述部分具有SEQIDNO:26中所阐述的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述F8编码序列的所述部分被沉默改变。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述编辑元件5'到3'包括F8编码序列的一部分和聚腺苷酸化序列。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述F8编码序列的所述部分由SEQIDNO:26中所阐述的序列组成。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶基因座是所述F8基因的核苷酸126,476与核苷酸126,477之间的核苷酸间键。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶基因座是与所述F8基因的核苷酸126,4763'相邻的核苷酸序列。
16.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述编辑元件5'到3'包括剪接受体位点、F8编码序列的一部分和任选地聚腺苷酸化序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中与所述靶基因座5'相邻的所述核苷酸在所述F8基因的内含子中。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述F8编码序列的所述部分由SEQIDNO:26中所阐述的序列组成。
19.根据权利要求18所述的方法，其中与所述靶基因座5'相邻的所述核苷酸在所述F8基因的内含子22中。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述外源性聚腺苷酸化序列是SV40聚腺苷酸化序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述SV40聚腺苷酸化序列具有SEQIDNO:23中所阐述的核苷酸序列。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编辑元件包括SEQIDNO:33中所阐述的核酸序列。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5'同源臂核苷酸序列与所述第一基因组区域至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述3'同源臂核苷酸序列与所述第二基因组区域至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基因组区域位于第一编辑窗口中，且所述第二基因组区域位于第二编辑窗口中。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第一编辑窗口由SEQIDNO:31、32或34中所阐述的核苷酸序列组成。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述第二编辑窗口由SEQIDNO:31、32或34中所阐述的核苷酸序列组成。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述第一编辑窗口由SEQIDNO:31中所阐述的核苷酸序列组成，且所述第二编辑窗口由SEQIDNO:32中所阐述的核苷酸序列组成。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基因组区域由SEQIDNO:31中所阐述的核苷酸序列组成。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二基因组区域由SEQIDNO:32中所阐述的核苷酸序列组成。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5'同源臂核苷酸序列和所述3'同源臂核苷酸序列中的每一个独立地具有约100到约4500个核苷酸的长度。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述校正基因组包括选自SEQIDNO:38-41组成的组的核酸序列。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述校正基因组进一步包括所述5'同源臂核苷酸序列5'的5'反向末端重复(5'invertedterminalrepeat；5'ITR)核苷酸序列和所述3'同源臂核苷酸序列3'的3'反向末端重复(3'invertedterminalrepeat；3'ITR)核苷酸序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述5'ITR核苷酸序列与SEQIDNO:18或46具有至少95％序列一致性，且所述3'ITR核苷酸序列与SEQIDNO:19、61或63具有至少95％序列一致性。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述5'ITR核苷酸序列与SEQIDNO:20具有至少95％序列一致性，且所述3'ITR核苷酸序列与SEQIDNO:21具有至少95％序列一致性。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述校正基因组包括选自SEQIDNO:42-45组成的组的核酸序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述校正基因组由选自SEQIDNO:42-45组成的组的核酸序列组成。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当在不存在外源性核酸酶的情况下在标准AAV转导条件条件下将所述AAV与B淋巴母细胞群活体外体接触时，所述编辑元件整合到所述靶基因座中的整合效率为至少2％。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当在不存在外源性核酸酶的情况下在标准AAV转导条件下将所述AAV与B淋巴母细胞群体活体外接触时，所述编辑元件整合到所述靶基因座中的等位基因频率为至少1％。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳包括AAV进化枝F衣壳蛋白。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述AAV进化枝F衣壳蛋白包括与SEQIDNO:1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中：所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸206的氨基酸是C；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸296的氨基酸是H；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸312的氨基酸是Q；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸346的氨基酸是A；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸464的氨基酸是N；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸468的氨基酸是S；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸501的氨基酸是I；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸590的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是G或Y；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸681的氨基酸是M；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸687的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸690的氨基酸是K；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸706的氨基酸是C；或所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸718的氨基酸是G。
44.根据权利要求42所述的方法，其中：
(a)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是G，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸718的氨基酸是G；
(b)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸296的氨基酸是H，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸464的氨基酸是N，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸681的氨基酸是M；
(c)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸687的氨基酸是R；
(d)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸346的氨基酸是A，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R；或
(e)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸501的氨基酸是I，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸706的氨基酸是C。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述衣壳蛋白包括SEQIDNO:1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736的氨基酸序列。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中所述AAV进化枝F衣壳蛋白包括与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
47.根据权利要求46所述的方法，其中：所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸151的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸160的氨基酸是D；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸206的氨基酸是C；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸296的氨基酸是H；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸312的氨基酸是Q；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸346的氨基酸是A；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸464的氨基酸是N；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸468的氨基酸是S；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸501的氨基酸是I；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸590的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是G或Y；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸681的氨基酸是M；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸687的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸690的氨基酸是K；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸706的氨基酸是C；或所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸718的氨基酸是G。
48.根据权利要求47所述的方法，其中：
(a)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是G，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸718的氨基酸是G；
(b)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸296的氨基酸是H，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸464的氨基酸是N，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸681的氨基酸是M；
(c)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸687的氨基酸是R；
(d)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸346的氨基酸是A，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R；或
(e)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸501的氨基酸是I，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸706的氨基酸是C。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述衣壳蛋白包括SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736的氨基酸序列。
50.根据权利要求41至49中任一项所述的方法，其中所述AAV进化枝F衣壳蛋白包括与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列。
51.根据权利要求50所述的方法，其中：所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸2的氨基酸是T；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸65的氨基酸是I；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸68的氨基酸是V；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸77的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸119的氨基酸是L；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸151的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸160的氨基酸是D；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸206的氨基酸是C；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸296的氨基酸是H；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸312的氨基酸是Q；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸346的氨基酸是A；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸464的氨基酸是N；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸468的氨基酸是S；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸501的氨基酸是I；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸590的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是G或Y；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸681的氨基酸是M；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸687的氨基酸是R；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸690的氨基酸是K；所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸706的氨基酸是C；或所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸718的氨基酸是G。
52.根据权利要求50所述的方法，其中：
(a)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸2的氨基酸是T，且
所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸312的氨基酸是Q；
(b)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸65的氨基酸是I，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是Y；
(c)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸77的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸690的氨基酸是K；
(d)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸119的氨基酸是L，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸468的氨基酸是S；
(e)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸626的氨基酸是G，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸718的氨基酸是G；
(f)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸296的氨基酸是H，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸464的氨基酸是N，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸681的氨基酸是M；
(g)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸687的氨基酸是R；
(h)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸346的氨基酸是A，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R；或
(i)所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸501的氨基酸是I，所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸505的氨基酸是R，且所述衣壳蛋白中对应于SEQIDNO:2的氨基酸706的氨基酸是C。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述衣壳蛋白包括SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736的氨基酸序列。
54.一种复制缺陷型腺相关病毒(AAV)，其包括：
a)AAV衣壳，其包括AAV进化枝F衣壳蛋白；和
b)校正基因组，其包括：(i)用于编辑所述F8基因中的靶基因座的编辑元件；(ii)所述编辑元件5'的5'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座5'的第一基因组区域具有同源性；和(iii)所述编辑元件3'的3'同源臂核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述靶基因座3'的第二基因组区域具有同源性。
55.根据权利要求54所述的AAV，其中所述编辑元件包括F8编码序列的一部分。
56.根据权利要求55所述的AAV，其中所述F8编码序列的所述部分编码SEQIDNO:25中所阐述的氨基酸序列。
57.根据权利要求56所述的AAV，其中所述F8编码序列的所述部分具有SEQIDNO:26中所阐述的氨基酸序列。
58.根据权利要求56所述的AAV，其中所述F8编码序列被沉默改变。
59.根据权利要求54至...
【专利技术属性】
技术研发人员：S查特吉，LJ史密斯，JL埃尔斯沃思，H鲁宾，JB赖特，JA麦克斯维甘，
申请(专利权)人：同源药物公司，希望之城公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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