一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法技术

本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。本发明专利技术提供了一种快速用于基因分型检测的LNA‑恒温扩增的新方法。RMA技术反应条件较温和，不存在DNA模板高温变性，只需常温条件下就能进行反应；反应时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段；通过荧光探针的使用，可以实现快速实时检测。而锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变检测特异性，适用于基因分型检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法
本申请属于试剂盒
，具体为一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(SNP)，指的是个体间DNA组序列同一位置单个核苷酸变异所引起的多态性。SNP位点是单个碱基的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，但大多数是转换。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因。SNPs的二态性，也有利于对其进行基因分型。目前，有许多方法被用来SNP的分型，如Taqman-MGB探针法、直接测序、限制性片段长度多态性分析法等。但是这些方法基本上全部依赖于PCR，操作复杂、检测周期长、需要复杂的仪器设备、成本较高。重组酶聚合酶扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。与PCR相比，RMA具有反应温度恒定、操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA产物的检测方法有凝胶电泳、实时荧光检测方法(real-time-RMA)、侧流层析(LFD-RMA)等。锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。本专利技术采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法进行基因分型检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。优选的，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、锁核酸修饰的检测SNP位点用的野生型探针(10μM)、锁核酸修饰的检测SNP位点用的突变型探针(10μM)、酶混合物、反应缓冲液、醋酸镁。优选的，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。优选的，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的T碱基与猝灭基团修饰的T碱基间隔2～5个碱基。优选的，所述荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)或HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，所述淬灭基团用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰；所述探针3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。优选的，所述SNP位点为A或C，所述SNP位点互补碱基为T或G；所述LNA探针覆盖SNP位点，在探针上SNP位点的上做LNA标记。一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒的检测方法，步骤如下：(1)提取待测样本DNA作为模板；(2)RMA扩增体系的配制：试剂用量/μL上游引物(10μM)2.0下游引物(10μM)2.0野生型探针(10μM)0.6突变型探针(10μM)0.6反应的酶干粉1管缓冲液buffer29.5醋酸镁(MgAc)(280mM)2.5模板DNA2.0ddH2O10.8总体积50.0反应体系在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟；(3)检测结果判定：对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。有益效果：本专利技术提供了一种快速用于基因分型检测的LNA-恒温扩增的新方法。RMA技术反应条件较温和，不存在DNA模板高温变性，只需常温条件下就能进行反应；反应时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段；通过荧光探针的使用，可以实现快速实时检测。而锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变检测特异性，适用于基因分型检测。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1CYP2D6C188T位点野生纯合型样本检测结果；图2CYP2D6C188T位点突变纯合型样本检测结果；图3CYP2D6C188T位点突变杂合型样本检测结果；图4MTHFRC677T位点野生纯合型样本检测结果；图5MTHFRC677T位点突变纯合型样本检测结果；图6MTHFRC677T位点突变杂合型样本检测结果。具体实施方式为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。实施例1LNA-RMA恒温扩增的方法用于人CYP2D6基因多态性的检测：基于CYP2D6基因突变序列的互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表所示：(LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；野生型探针的荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)修饰，突变型探针的荧光基团用HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，淬灭基团都用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰。)一种基于LNA-RMA技术检测人CYP2D6基因多态性的方法，包括以下步骤：(1)采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。


2.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、锁核酸修饰的检测SNP位点用的野生型探针(10μM)、锁核酸修饰的检测SNP位点用的突变型探针(10μM)、酶混合物、反应缓冲液、醋酸镁。


3.如权利要求2所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。


4.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的T碱基与猝灭基团修饰的T碱基间隔2～5个碱基。


5.如权利要求4所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)或HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，所述淬灭基团用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰；所述探针3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。


6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，陈龙，李佳慧，张瑶，孙玉凤，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37