一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法技术

本发明专利技术公开一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，涉及扩增基因序列技术领域。本方法利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。本方法使用信息学的方法拼接得到目的基因序列全长，两个引物都是基于基因已知片段设计，方法简单，提高扩展效率，保证扩增序列的准确性，有助于推动未知序列扩增技术的发展。

【技术实现步骤摘要】
一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法
本专利技术涉及扩增基因序列
，具体涉及一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法。
技术介绍
扩增基因序列是探明基因功能的基础。传统的扩增未知基因序列的方法主要通过cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends，RACE)。它是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法。其原理是利用mRNA的末端的特殊序列，设计含有接头引物，与保守序列的特异引物扩增获得未知序列，再进行拼接，得到基因全序列。RACE技术需要使用到RNA末端的特殊引物，方法复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对现有RACE技术存在的需要使用到RNA末端的特殊引物，方法复杂的不足，提供一种基于转录组测序的简便快速获得未知序列片段的新方法。本方法利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列。以获取的基因序列为模板，设计引物，扩增目的基因条带。该方法简单方便，无需合成特殊引物，扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。


2.根据权利要求1所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，用Trizol试剂或者RNAisoPlus试剂提取金线莲总RNA；
S2，以提取的金线莲总RNA为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，合成cDNA第一链；
S3，以cDNA第一链为模板，用cDNA第二链合成试剂盒合成cDNA第二链；
S4，对得到的cDNA第二链样品，建立cDNA文库，再进行总RNA测序，对测序数据过滤、组装和去冗余后获得金线莲Unigene序列，对金线莲Unigene序列进行功能注释；
S5，获取除金线莲外的其他兰科植物的基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，获取与所述其他兰科植物的基因序列相同功能的金线莲的基因序列，以所述金线莲的基因序列为模板，设计引物并扩增得到目的基因。


3.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
(1)取金线莲植株，加液氮快速研磨成粉状，取50～150mg装入离心管，加入0.5～1.5mLRNAisoPlus，摇晃离心管使金线莲粉状样品与RNAisoPlus充分混匀后，静置5～15min；
(2)以10000～14000g的离心力，2～6℃条件下，离心5～15min，取离心后离心管中的上清液300～900μL，放置于新的离心管中；
(3)向放置上清液的试管中加入50～250μL氯仿，摇晃混匀，静置5～15min；
(4)以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min；
(5)将上清液200～400μL转移至新的离心管中，加入200～400μL异丙醇混匀，静置5～15min；
(6)10000～14000g的离心力、2～6℃条件下，离心5～15min，吸弃离心管中的上清液，先后加入500～1000μL无水乙醇和100～400μLRNase-free水，混匀以洗涤RNA；以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min，吸弃去上清液；
(7)重复步骤(6)；
(8)吸弃去上清的离心管于室温中干燥5～30min，向干燥的离心管中加入20～40μL的RNase-free水，以溶解RNA；
(9)RNA溶解后，测定260和280nm吸光值，计算总RNA浓度和OD260/OD280值；并进行电泳分离，检测总RNA样品质。


4.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
(1)取总RNA0.5～1.5μg、dNTPMixture0.5～1.5μL、oligo(dT)180.5～1.5μL和RNasefreeddH2O1～10μL，配制逆转录混合液I于离心管中；
(2)取5×PrimeScriptTMBuffer3～5μL、DTT(100μmol/L)0.1～0.5μL、RNaseInhibitor0.1～1μL、PrimeScriptTMReverseTranscriptase0.5～1.5μL和RNasefreeddH2O1～10μL，配制逆转录混合液II于另一离心管中；
(3)将逆转录混合液I在50～68℃温浴3～8min后，冰浴1～3min；
(4)瞬时离心逆转录混合液I为2～15秒使液体混合液收集到离心管底部后，加入逆转录混合液II，瞬时离心2～15秒使液体混合液收集到离心管底部后30～50℃反应30～60min；
(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨琳，张君诚，张杭颖，
申请(专利权)人：三明学院，
类型：发明
国别省市：福建;35