一种利用In-Fusion PCR技术进行基因定点突变的方法技术

本发明专利技术提供一种利用In‑Fusion PCR技术进行基因定点突变的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术运用In‑Fusion PCR技术加上引物突变对靶基因进行体外定点突变，可用于各种基因位点突变，改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。

【技术实现步骤摘要】
一种利用In-FusionPCR技术进行基因定点突变的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种基因定点突变技术，特别涉及一种采用In-fusion技术结合引物突变快速进行基因定点突变的方法。
技术介绍
定点突变(site-directedmutagenesis)技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。该技术在生物和医学领域中的应用非常广泛。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变。寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤：其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要的过程：①将待突变基因克隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA，④合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子；⑤转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因；⑥对突变体基因进行序列分析。PCR介导的定点突变法：以PCR为介导的定点突变为基因修饰、改造提供了另一条途径。如通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的。还可以在所设计的引物5’端加入合适的限制性内切酶位点，为PCR扩增产物后续的克隆提供方便。经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。盒式突变：盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。总体而言，不管哪一种定点突变方法，其主要缺点是操作过程环节复杂、周期长、成本高，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。In-FusionPCR技术是一种简便高效的克隆技术，能够将单个或多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中。In-FusionPCR技术采用In-Fusion酶，此酶通过识别DNA片段或线性化载体末端15bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。总而言之，In-FusionPCR技术是一种简便高效的克隆技术，不用受到限制性内切酶的限制，且克服了常规克隆技术的繁复、周期长等缺点。In-FusionPCR技术构建一个重组质粒仅需要两天时间，极大了节省重组质粒构建时间。但是，目前尚没有文献报道利用In-FusionPCR技术结合引物突变进行靶基因的定点突变。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种利用In-FusionPCR技术结合引物突变对靶基因快速定点突变的方法。该方法运用In-FusionPCR技术加上引物突变对靶基因进行体外定点突变，可用于各种基因位点突变，改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。本专利技术提供一种进行基因定点突变的方法，利用In-fusionPCR技术结合引物突变实现靶基因的定点突变。优选的，所述进行基因定点突变的方法的步骤包括设计突变引物、利用所设计引物进行PCR并使用In-Fusion技术连接PCR产物构建突变质粒，进行转化与鉴定。优选的，所述进行基因定点突变的方法具体步骤为：(1)设计突变引物：根据靶基因序列设计两对引物，分别是“Infusion引物1+突变引物”，“Infusion引物2”，“Infusion引物3”和“Infusion引物4”；其中“Infusion引物1+突变引物”含有Infusion引物，突变序列和其它与靶基因相同序列，“Infusion引物2”含有Infusion引物和其它与靶基因互补序列，“Infusion引物1”和“Infusion引物2”的Infusion引物序列互补；“Infusion引物3”含有Infusion引物和其它与靶基因相同序列，“Infusion引物4”含有Infusion引物和其它与靶基因互补序列，“Infusion引物3”和“Infusion引物4”的Infusion引物序列互补；(2)构建突变质粒：首先，以构建好的pcDNA3.1-靶基因质粒为模板，以“Infusion引物1+突变引物”和“Infusion引物4”为上游引物和下游引物进行PCR，其PCR产物命名为产物1；其次，以构建好的pcDNA3.1-ATGL质粒为模板，以“Infusion引物3”和“Infusion引物2”为上游引物和下游引物进行PCR，其PCR产物命名为产物2；利用In-Fusion技术把产物1和产物2连接成一个完整的含有突变序列的pcDNA3.1-靶基因质粒；(3)转化与鉴定：将获得的含有突变序列的pcDNA3.1-靶基因质粒转化入DH5a菌中后，提取质粒进行测序，鉴定是否突变成功。优选的，所述的靶基因为ATGL基因，其核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。优选的，将ATGL基因中编码第78位的赖氨酸位点突变为丙氨酸位点。优选的，所用引物序列如SEQIDNO：3-SEQIDNO：6所示。本专利技术还提供ATGL基因编码第78位的赖氨酸位点突变为丙氨酸位点在制备防治脂肪累积疾病药物中的应用。本专利技术具有以下技术效果：现在定点突变方法其主要缺点是操作过程环节复杂、周期长、成本高，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。In-FusionPCR技术是一种简便高效的克隆技术，能够将单个或多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中。目前尚未有利用In-FusionPCR技术结合引物突变方法进行基因的定点突变。现在技术利用In-FusionPCR技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种进行基因定点突变的方法，其特征在于，利用In-fusion PCR技术结合引物突变实现靶基因的定点突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种进行基因定点突变的方法，其特征在于，利用In-fusionPCR技术结合引物突变实现靶基因的定点突变。


2.如权利要求1所述的进行基因定点突变的方法，其特征在于，具体步骤包括设计突变引物，利用所设计引物进行PCR并使用In-Fusion技术连接PCR产物构建突变质粒，最后进行转化与鉴定。


3.如权利要求2所述的进行基因定点突变的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：
(1)设计突变引物：根据靶基因序列设计两对引物，分别是“Infusion引物1+突变引物”，“Infusion引物2”，“Infusion引物3”和“Infusion引物4”；其中“Infusion引物1+突变引物”含有Infusion引物，突变序列和其它与靶基因相同序列，“Infusion引物2”含有Infusion引物和其它与靶基因互补序列，“Infusion引物1”和“Infusion引物2”的Infusion引物序列互补；“Infusion引物3”含有Infusion引物和其它与靶基因相同序列，“Infusion引物4”含有Infusion引物和其它与靶基因互补序列，“Infusion引物3”和“Infusion引物4”的Infusion引物序列互补；
(2)构建突变质粒：...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪宏海，夏勇，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：广东;44