【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞选择和修饰细胞代谢的方法相关申请的交叉引用本申请要求美国临时专利申请U.S.S.N.62/625,773(提交于2018年2月2日)的优先权及权益，其全部内容通过引用全文纳入本文。专利
本公开涉及用于鉴定、选择或培养包含对象核酸(subjectnucleicacid)序列的细胞的方法和组合物。
技术介绍
通过将产物的表达与能够合成必需化合物的异位酶的表达结合可以将对于生长所需的必需化合物为营养缺陷型的真核细胞用于表达异源性产物。例如，在没有外部供应的胸苷的情况下，胸苷营养缺陷型突变鼠细胞不能生长(Ayusawa等(1981)SomaticCellGenet.7(5):523-534)。恢复胸苷酸合酶活性的回复体(revertant)能够在胸苷饥饿条件下生长。哺乳动物细胞表达系统通常用于生产重组生物产物，如治疗生物制剂。然而，由于难以高效生成高效表达大量所需产物的稳定细胞系，大规模生产这类产物与较高的初始成本有关。因此，本领域中需要用于生产这样的细胞的改进的方法和组合物，所述细胞可以用于生产重组生物
【技术保护点】
1.一种鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：/na)提供包含以下的细胞：异源性核酸，例如，载体，例如，可复制载体或整合载体，其包含：/n(i)所述对象核酸序列；和/n(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径(例如，脯氨酸合成途径)中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和/nb)在足以允许包含所述核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的细胞相同的细胞的生长的培养基存在的情况下培养包含所述核酸序列的细胞，/n从而鉴定、选择或培养包含所述异源性核酸序列的细胞。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180202 US 62/625,7731.一种鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含以下的细胞：异源性核酸，例如，载体，例如，可复制载体或整合载体，其包含：
(i)所述对象核酸序列；和
(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径(例如，脯氨酸合成途径)中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含所述核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的细胞相同的细胞的生长的培养基存在的情况下培养包含所述核酸序列的细胞，
从而鉴定、选择或培养包含所述异源性核酸序列的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述异源性核酸包括载体。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸包括可复制载体，例如，自我可复制载体。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸包括整合载体。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述培养基还包含所述酶活性的抑制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述抑制剂是氨基酸。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述抑制剂不是氨基酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括鉴定包含异源性核酸序列的细胞。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括选择包含异源性核酸序列的细胞。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括培养包含异源性核酸序列的细胞。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包括多个载体(例如，其中所述对象核酸以及导致酶活性水平升高的核酸包含在多个载体中，例如，在不同的载体上)。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包括多个整合载体(例如，其中所述对象核酸以及导致酶活性水平升高的核酸包含在多个整合载体中，例如，在不同的载体上)。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包括多个自我复制载体(例如，其中所述对象核酸以及导致酶活性水平升高的核酸包含在多个自我复制载体中，例如，在不同的载体上)。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸被整合到所述细胞的基因组中，例如，染色体基因组。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括天然产生的氨基酸。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括表1中所列的氨基酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是丙氨酸。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是亮氨酸。
19.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是异亮氨酸。
20.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是甲硫氨酸。
21.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是缬氨酸。
22.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是苯丙氨酸。
23.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是天冬酰胺。
24.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是半胱氨酸。
25.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是谷氨酰胺。
26.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是丝氨酸。
27.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是苏氨酸。
28.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是天冬氨酸。
29.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是谷氨酸。
30.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是精氨酸。
31.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是组氨酸。
32.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是赖氨酸。
33.如权利要求16所述的方法，其中，所述氨基酸是甘氨酸。
34.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸选自脯氨酸，酪氨酸和色氨酸。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述氨基酸是脯氨酸。
36.如权利要求34所述的方法，其中，所述氨基酸是酪氨酸。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述氨基酸是色氨酸。
38.如权利要求5-37中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂结合所述酶，例如，其结合并抑制所述酶。
39.如权利要求5-38中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂抑制所述酶的转录。
40.如权利要求5-39中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂抑制所述酶的翻译。
41.如权利要求5-40中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括核酸，例如，RNA，例如，反义或siRNA。
42.如权利要求5-41中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括适配体。
43.如权利要求5-42中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括小分子。
44.如权利要求5-43中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物的类似物。
45.如权利要求5-44中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述氨基酸的类似物，例如，脯氨酸、酪氨酸或色氨酸的类似物。
46.如权利要求5-45中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括竞争性抑制剂。
47.如权利要求5-46中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂抑制用于合成氨基酸的限速酶，例如，所述抑制剂抑制用于在培养基上合成氨基酸的限速酶。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括脯氨酸。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述酶包括吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)分子。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包含编码P5CS分子的序列。
51.如权利要求5-50中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物，或其类似物、变体或衍生物。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是脯氨酸的类似物，例如，L-氮杂-2-环丁烷羧酸，3,4-脱氢-L-脯氨酸，或L-4-噻唑烷羧酸。
53.如权利要求5-52中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括脯氨酸并且所述酶和抑制剂选自表1。
54.如权利要求5-16、34或38-47中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括酪氨酸并且所述酶和/或抑制剂选自表1。
55.如权利要求5-16、34、38-47或54中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包含序列，所述序列编码多肽和/或酪氨酸生物合成酶的抑制剂。
56.如权利要求54或55中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物的类似物。
57.如权利要求5-16、34、38-47或54-56中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是酪氨酸的类似物。
58.如权利要求5-16、34、38-47或54-57中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括酪氨酸并且所述酶和抑制剂选自表1。
59.如权利要求5-16、34或38-47中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括色氨酸并且所述酶和/或抑制剂选自表1。
60.如权利要求5-16、34、38-47或59中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包含序列，所述序列编码多肽和/或色氨酸生物合成酶的抑制剂。
61.如权利要求59或60中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物的类似物。
62.如权利要求5-16、34、38-47或59-61中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是色氨酸的类似物。
63.如权利要求5-16、34、38-47或59-62中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括色氨酸并且所述酶和抑制剂选自表1。
64.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括共同培养酶活性未升高的细胞和活性升高的细胞。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述活性升高的细胞比活性未升高的细胞更快地生长，例如，快约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000倍。
66.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，少于约0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50百分比选定的细胞(例如，基于生长选择)缺少所述核酸。
67.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括选择表现出生长的细胞。
68.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括真核细胞。
69.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括动物细胞。
70.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括哺乳动物细胞。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括啮齿动物细胞。
72.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括CHO细胞。
73.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括GSKOCHO细胞。
74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，编码所述酶的序列的内源性拷贝已失活，例如，在结构或控制区域包含缺失。
75.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，编码第二氨基酸合成酶的序列的内源性拷贝已失活，例如，在结构或控制区域包含缺失。
76.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，编码GS的序列的内源性拷贝已失活，例如，在结构或控制区域包含缺失。
77.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述对象核酸序列编码肽分子。
78.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述对象核酸序列是异源性的。
79.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述异源性肽分子选自表5-8中的任一项。
80.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括选择在所述培养基上生长的细胞。
81.如权利要求80所述的方法，其中，所述培养基包含抑制剂。
82.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括：
1)选择在所述培养基上生长的细胞；和
2)在第二组培养条件下培养所述细胞，例如，在第二培养基上，例如，使选定的细胞经历第二选择。
83.如权利要求82所述的方法，其中：
1)中所述培养基包含所述抑制剂；和
2)中所述第二培养基包含所述抑制剂。
84.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括：
1)选择在所述培养基上生长的细胞；和
2)在第二组培养条件下培养所述细胞，例如，在第二培养基上，例如，使选定的细胞经历第二选择，
其中，1)和2)之一的培养基中所述抑制剂的浓度大于1)和2)中另一培养基中所述抑制剂的浓度。
85.如权利要求84所述的方法，其中：
1)中所述抑制剂的浓度大于2)中所述抑制剂的浓度。
86.如权利要求84所述的方法，其中，2)中所述抑制剂的浓度大于1)中所述抑制剂的浓度。
87.如权利要求84-86中任一项所述的方法，其包括：
其中具有较低浓度所述抑制剂的步骤中的所述培养基基本上不含抑制剂。
88.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，(ii)中所述核酸序列可操作地连接控制序列，例如，启动子。
89.如权利要求88所述的方法，其中，所述控制序列包含选自下述的序列：SV40，mCMV，hCMV，或PGK启动子，或其变体。
90.如权利要求88所述的方法，其中，所述控制序列控制LMM的表达。
91.如权利要求90所述的方法，其中，所述控制序列和LMM如表3任一行所列。
92.如权利要求90所述的方法，其中，所述控制序列包含SV40启动子，并且所述LMM是鼠SCD1。
93.如权利要求90所述的方法，其中，所述控制序列包含SV40启动子，并且所述LMM是S...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·杨，C·M·司迈尔斯，C·M·雅克斯，A·J·拉切尔，G·辛格，J·坝基，J·罗布尔，
申请(专利权)人：隆萨有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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