【技术实现步骤摘要】
一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含量的方法
本专利技术涉及细胞培养领域，具体为一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含量的方法。
技术介绍
三叶青系葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，又名金线吊葫芦，是我国特有的珍稀名贵药材，在我国浙江、四川、福建、江西、云南、湖南、广西等地区均有分布，2018年被列入新“浙八味”重点培育品种之一。具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效，常用小儿高热惊厥、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性脑膜炎、毒蛇咬伤、扁桃体炎、跌打损伤等疾病的治疗，被民间称为“植物抗生素”，具有非常高药用和经济价值。因此，如何更加高效地利用三叶青叶生产得到药物，是技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含量的方法，该方法通过制备三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系，可增大培养得到的三叶青植株内的有效药用成分的优点。为实现上述目的，本专利技术提供
【技术保护点】
1.一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)、三叶青叶悬浮细胞的制备：/n(1.1)选取生长良好、无病虫害的野生三叶青嫩叶，用流水洗净，风干表面水分，并于超净台中进行消毒，得到消毒完成后的三叶青叶片；/n(1.2)在消毒完成后的三叶青叶片上剪取5×5mm面积大小的叶片，接种于诱导培养基A上，诱导得到愈伤组织；/n(1.3)选取愈伤组织，接种于固体培养基B中，培养温度28℃，光照12h/d，光照强度2000Lx，诱导后获得的疏松愈伤组织；/n(1.4)将获得诱导的疏松愈伤组织继代培养2次～3次，用无菌镊...
【技术特征摘要】
1.一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、三叶青叶悬浮细胞的制备：
(1.1)选取生长良好、无病虫害的野生三叶青嫩叶，用流水洗净，风干表面水分，并于超净台中进行消毒，得到消毒完成后的三叶青叶片；
(1.2)在消毒完成后的三叶青叶片上剪取5×5mm面积大小的叶片，接种于诱导培养基A上，诱导得到愈伤组织；
(1.3)选取愈伤组织，接种于固体培养基B中，培养温度28℃，光照12h/d，光照强度2000Lx，诱导后获得的疏松愈伤组织；
(1.4)将获得诱导的疏松愈伤组织继代培养2次～3次，用无菌镊子夹碎，接种在装有100mL～150mL液体培养基C的容器中，培养温度28℃，120r/min，振荡培养；
(1.5)培养完成后，过细胞筛，将细胞悬浮培养物摇匀，静置，取上层培养液，并向容器里注入液体培养基C，即可得到三叶青叶悬浮细胞；
(2)、三叶青叶内生真菌TH01的活化及其孢子悬浮液的制备：
(2.1)超净工作台内，将三叶青内生真菌接种到PDA中，放入电热恒温培养箱中培养，培养温度为28℃，培养5d完成活化；
(2.2)然后在超净工作台内，取5mL无菌水，加入盛装有活化完成的三叶青内真生菌的容器中，震荡，接种环刮去孢子，并用移液枪吸取孢子液；
(2.3)孢子液倒入无菌离心管中，重复上述操作4～8次，使用无菌水的总体积为30～40ml，充分震荡混匀，制得孢子悬浮液；
(3)三叶青叶悬浮细胞与内生真菌的共培养体系的制备：
(3.1)向容器内加入30mL～50mL含有液体培养基C，用于培养三叶青叶悬浮细胞；
(3.2)三叶青叶悬浮细胞初始接入量为0.4×103个/mL，培养10天后，接入内生真菌的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.4×103个/mL；
(3.3)将上述盛装有培养体系悬浮液的容器置于摇床上振荡培养，培养完成后，得到三叶青叶悬浮细胞与内生真菌的共培养体系。
2.根据权利要求1所述的一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含量的方法，其特征在于，在步骤(1.5)中，培养时间为10天，细胞筛的孔径为60目，静置时间为5min。
3.根据权利要求1所述的一种基于三叶青叶悬浮细胞与其内生真菌共培养体系的可提高次生代谢产物含...
【专利技术属性】
技术研发人员：许海顺，徐娟，鞠正光，訾豪然，吴学谦，白岩，王红珍，邵清松，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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