一种生长因子固体制剂及其制备方法技术

发明专利技术公开了一种生长因子固体制剂的制备方法，属于生物技术领域，其技术方案要点是，包括以下步骤：S1：甲基封端聚乙二醇与N，N’‑二环己基碳二亚胺、N‑异丙基丙烯酰胺、丙烯酰氯依次接枝反应制得产物A；S2：将产物A溶于含有生长因子的磷酸盐缓冲液中制成混合液1，α‑环糊精以PBS缓冲液溶解制混合液2，将混合液1加入混合液2，搅拌反应24h，制备生长因子胶束；S3：将S2中的生长因子胶束离心，转速20000r/min，离心30min，取上清液冷冻储存，经过真空干燥形成冻干粉。本发明专利技术制得的固体制剂，不仅能促进细胞增殖，而且可以延长生长因子的活性时间，提高了生长因子的利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种生长因子固体制剂及其制备方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种生长因子固体制剂及其制备方法。
技术介绍
生长因子是一类调节微生物正常生长代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行结合的有机物。是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质，存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。脂肪干细胞因其具有来源丰富，易于培养、免疫排斥小，以及应用不受伦理学约束等优越性，而被视为组织工程学理想的种子细胞，在组织创伤修复领域中具有良好的应用前景和研究价值。近年来，脂肪干细胞被证实对软组织创伤修复具有促进作用，关于其机制的研究中，更多的学者倾向于脂肪干细胞的旁分泌机制，即脂肪干细胞分泌的各种生长因子对创伤部位细胞的修复功能具有促进作用。而生长因子的应用完全依赖于它的活性，没有活性的生长因子毫无作用。目前，关于生长因子的制剂的使用存在以下缺陷，在溶液中的活性时间较短，大大限制了生长因子的使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生长因子固体制剂及其制备方法，该方法制得的固体制剂，不仅能促进细胞增殖，而且可以延长生长因子的活性时间，提高了生长因子的利用率。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种生长因子固体制剂的制备方法，包括以下步骤：S1：甲基封端聚乙二醇与N，N’-二环己基碳二亚胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰氯依次接枝反应制得产物A；S2：将产物A溶于含有生长因子的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中制成混合液1，α-环糊精以PBS缓冲液溶解制混合液2，将混合液1加入混合液2，搅拌反应22-24h，制备生长因子胶束；S3：将S2中的生长因子胶束离心，转速15000-20000r/min，离心30-50min，取上清液冷冻储存，经过真空干燥形成冻干粉。进一步的，S1中的产物A的制备过程如下：S1.1：甲基封端聚乙二醇与N，N’-二环己基碳二亚胺以二氯甲烷溶解，4-二甲氨基吡啶以二氯甲烷溶解，二者混合搅拌均匀，反应后过滤得到滤液，将滤液蒸干得固体残渣，固体残渣经丙酮萃取、过柱、旋干得到产物1；S1.2：将产物1与N-异丙基丙烯酰胺以甲苯溶解，除氧，然后在氩气保护下反应，反应完后，加入无水乙醚沉淀得到产物2；S1.3：在产物2中加入四氢呋喃，在氩气保护下加入乙二胺，搅拌反应2.5-3h，反应完后，加入无水乙醚沉淀得到产物3；S1.4：将产物3以二氯甲烷溶解，通氩气除氧加入三乙胺，再加入丙烯酰氯，冰浴反应20-30min，撤去冰浴，24-26℃下反应24-28h，得到产物A。进一步的，S1.1中甲基封端聚乙二醇的用量与N，N’-二环己基碳二亚胺的比例为5-6:1W/W，4-二甲氨基吡啶的用量与原料N，N’-二环己基碳二亚胺的比例为0.3-0.5:1W/W，二氯甲烷的用量与原料N，N’-二环己基碳二亚胺的比例为150-200:1V/W，用丙酮萃取2-3次，过柱的洗脱液为二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷与甲醇的体积比为20:1。进一步的，S1.2中N-异丙基丙烯酰胺的用量与产物1的比例为1.5-2:1W/W，甲苯与产物1的比例为50-52:1V/W，反应温度为65-70℃，反应时间为5-6h。进一步的，所述生长因子来源于脂肪干细胞。进一步的，所述脂肪干细胞的冻存过程，去除培养基中的培养液，加入pH值为7-7.5的PBS缓冲液润洗细胞，加入胰蛋白酶，在35-37℃消化1-3min，然后加入2％胎牛血清终止消化，离心，之后加入冻存液，转入冻存管，3-4℃放置30-35min，-20～-18℃放置1-1.2h，最后转入-80℃冰箱保存。进一步的，所述冻存液的成分包括，30％的胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：1.首先制得一种亲水性两嵌段聚合物产物A，之后产物A与α-环糊精的聚合形成一种中空的胶束，组装在产物A分子链段上的环糊精分子之间会因氢键的相互作用紧密排列，导致原本柔性的产物A的分子链因包合而形成刚性的结构，性质也变为疏水，与此同时，俄未环糊精包合的产物A的聚合物分子链段仍保持柔性和亲水性，整个体系因此形成类似空心胶束的结构；2.这种中空的胶束为内腔为水环境，所以适合包覆对有机溶剂较为敏感的生长因子，因此制得的生长因子胶束能够在真空干燥之后，使得其中的生长因子保持较高的活性，从而提高生长因子的利用率。具体实施方式本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1：一种生长因子固体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：甲基封端聚乙二醇与N，N’-二环己基碳二亚胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰氯依次接枝反应制得产物A；其中产物A的制备过程如下：S1.1：取甲基封端聚乙二醇500mg，N，N’-二环己基碳二亚胺85mg溶于10mL的二氯甲烷中，取2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸145mg，4-二甲氨基吡啶15mg溶于10mL二氯甲烷中；将二者混合搅拌均匀，25℃下搅拌10h，过滤得到滤液，将滤液蒸干得固体残渣，固体残渣采用丙酮(10mL*3)萃取3次，然后经过二氧化硅凝胶柱，采用二氯甲烷为洗脱液，最后用旋转蒸发仪旋干得到产物1。S1.2：取产物1，117mg，N-异丙基丙烯酰胺209mg，溶解于20mL的甲苯溶液中，鼓泡除氧，然后在氩气保护下于70℃反应6h，反应完后，采用过量的无水乙醚沉淀得到产物2。S1.3：取得产物2，150mg，加入2mL四氢呋喃，鼓泡除氧，在氩气保护下加入1.5ml乙二胺，搅拌反应3h，反应完后，加入过量无水乙醚沉淀得到产物3；S1.4：取得300mg产物3，加入10mL二氯甲烷溶解，通氩气除氧加入75μL三乙胺，再加入45μL丙烯酰氯，冰浴反应20min，撤去冰浴25℃下反应24h，得到产物A。S2：首先，采用氢氧化钠和磷酸二氢钾配制pH值为7.2的PBS缓冲液，取得200mg产物A溶于含有500ng生长因子的1mL的PBS缓冲液中制成混合液1，将400mg的α-环糊精溶解于4mLPBS缓冲液中制混合液2，将混合液1加入混合液2，搅拌反应24h，制备生长因子胶束；S3：将S2中的生长因子胶束离心，转速15000r/min，离心40min，取上清液冷冻储存，经过真空干燥形成冻干粉。其中的生长因子的来源于脂肪干细胞，脂肪干细胞的冻存过程，去除培养基中的培养液，加入pH值为7.5的PBS缓冲液润洗细胞，加入胰蛋白酶，在35℃消化1min，然后加入2％胎牛血清终止消化，离心，之后加入冻存液，冻存液为30％的胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的混合物，然后转入冻存管，4℃放置30min，-18℃放置1h，最后转入-80℃冰箱保存。实施例2：...

【技术保护点】
1.一种生长因子固体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：甲基封端聚乙二醇与N，N’-二环己基碳二亚胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰氯依次接枝反应制得产物A；/nS2：将产物A溶于含有生长因子的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中制成混合液1，α-环糊精以PBS缓冲液溶解制混合液2，将混合液1加入混合液2，搅拌反应22-24h，制备生长因子胶束；/nS3：将S2中的生长因子胶束离心，转速15000-20000r/min，离心30-50min，取上清液冷冻储存，经过真空干燥形成冻干粉。/n

【技术特征摘要】
1.一种生长因子固体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：甲基封端聚乙二醇与N，N’-二环己基碳二亚胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰氯依次接枝反应制得产物A；
S2：将产物A溶于含有生长因子的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中制成混合液1，α-环糊精以PBS缓冲液溶解制混合液2，将混合液1加入混合液2，搅拌反应22-24h，制备生长因子胶束；
S3：将S2中的生长因子胶束离心，转速15000-20000r/min，离心30-50min，取上清液冷冻储存，经过真空干燥形成冻干粉。


2.根据权利要求1所述的生长因子固体制剂的制备方法，其特征在于，S1中的产物A的制备过程如下：
S1.1：甲基封端聚乙二醇与N，N’-二环己基碳二亚胺以二氯甲烷溶解，4-二甲氨基吡啶以二氯甲烷溶解，二者混合搅拌均匀，反应后过滤得到滤液，将滤液蒸干得固体残渣，固体残渣经丙酮萃取、过柱、旋干得到产物1；
S1.2：将产物1与N-异丙基丙烯酰胺以甲苯溶解，除氧，然后在氩气保护下反应，反应完后，加入无水乙醚沉淀得到产物2；
S1.3：在产物2中加入四氢呋喃，在氩气保护下加入乙二胺，搅拌反应2.5-3h，反应完后，加入无水乙醚沉淀得到产物3；
S1.4：将产物3以二氯甲烷溶解，通氩气除氧加入三乙胺，再加入丙烯酰氯，冰浴反应20-30min，撤去冰浴，24-26℃下反应24-28h，得到产物A。


3.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽宇，
申请(专利权)人：苏州瑞微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32