骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾病中的应用制造技术

本发明专利技术涉及骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾病中的应用，骨髓间充质干细胞外泌物在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用，骨髓间充质干细胞外泌物在制备预防椎间盘退行性疾病药物中的应用，治疗椎间盘退变的药物，其中，有效成分为骨髓间充质干细胞外泌物；有益效果是：为椎间盘退行性疾病治疗提供了一种新的治疗物质，填补了骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾治疗中应用空白；同时提供了新的治疗椎间盘退行性疾的药物。

【技术实现步骤摘要】
骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾病中的应用
本专利技术涉及椎间盘退行性疾病治疗
，尤其涉及骨髓间充质干细胞外泌物一种治疗药物。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，经诱导后可分化为多种组织和细胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反应，是再生医学中一种较为理想的种子细胞。人骨髓间充质干细胞(humanbonemesenchymalstemcells，hBMSCs)在可以通过体外扩增的方式培养，但在体外培养中，随着培养代数的增加，hBMSCs逐渐显示出衰老的特征，即生长速度逐渐变慢，并逐渐丧失向各胚层分化的能力，细胞形态也由长梭形变得扁平粗大，继而失去临床应用价值。每次从骨髓原代培养，能够用于细胞治疗的hBMSCs数量非常有限。外泌体是近年来发现的一种干细胞分泌的重要成分。外泌体是一种直径在30-100nm之间的脂质双分子囊泡，可携带细胞特异性表达的核酸、脂质、蛋白质等。外泌体通过细胞胞吐的方式分泌，当外泌体在外环境中与靶细胞接触后，可以通过胞膜融合的方式将生物分子传递给靶细胞。腰椎退行性病变是指腰椎自然老化、退化的生理病理过程。腰椎是人体躯干活动的枢纽，而所有的身体活动都无一不在增加腰椎的负担，随着年龄的增长，过度的活动和超负荷的承载，使腰椎加快出现老化。严重的腰椎退行性病变可以引起腰腿痛甚至神经损害，影响工作能力和生活质量。常用的药物包括非甾体类抗炎药、阿片类镇痛药、抗抑郁药及肌松药，其中前两类药物在短期内能较有效的缓解症状，而抗抑郁药及肌松药的效果则不甚明显。目前尚无间充质干细胞外泌物在腰椎退行性病变治疗药物中的应用研究。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾病中的应用，主要填补了骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾治疗中应用空白。为了解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：骨髓间充质干细胞外泌物在治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。骨髓间充质干细胞外泌物在预防椎间盘退行性疾病药物中的应用。一种方式，所述椎间盘退行性疾病为椎间盘退变。治疗椎间盘退变的药物，其中，有效成分为骨髓间充质干细胞外泌物。一种方式，所述外泌物为过表达sestrin2的骨髓间充质干细胞外泌物。一种方式，所述骨髓间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。一种方式，其制备方法为，获取骨髓间充质干细胞BMSC，提取分离并培养，慢病毒转染BMSC获取过表达sestrin-2的BMSC，获取过表达sestrin-2的BMSC的细胞培养液，从中提取外泌体。一种方式，慢病毒为pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro-SESN2。sestrin2蛋白在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。本专利技术的有益效果是：为椎间盘退行性疾病治疗提供了一种新的治疗物质，填补了骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾治疗中应用空白；同时提供了新的治疗椎间盘退行性疾的药物。附图说明图1为BMSC三系分化(成骨、成软骨、成脂)能力检测结果示意图；图2为转染sestrin-2慢病毒的BMSC，荧光显示转染情况及Westernblot分析结果；图3为超速离心法获取的BMSC外泌体，对照组BMSC获取的外泌体为Controlexos，过表达sestrin-2的BMSC获取的外泌体为Over-exos；图4为NPC细胞TUNEL凋亡检测及衰老染色结果；图5为大鼠尾椎X线图像，针刺造模及干预后第4周与8周；图6为大鼠尾椎MRI图像，针刺造模及干预后第4周与8周；图7为大鼠尾椎的HE染色及组织评分；图8为NPC各组Sestrin-2、Bcl-2、Bax及P16蛋白表达情况；图9为Sestrin-2含量影响外泌体对NPC的治疗效果情况。具体实施方式下面结合具体实施方式进行进一步说明：骨髓间充质干细胞外泌物在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。骨髓间充质干细胞外泌物在制备预防椎间盘退行性疾病药物中的应用。所述椎间盘退行性疾病为椎间盘退变。治疗椎间盘退变的药物，其中，有效成分为骨髓间充质干细胞外泌物。所述外泌物为过表达sestrin2的骨髓间充质干细胞外泌物。所述骨髓间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。上述外泌物制备方法为，获取骨髓间充质干细胞BMSC，提取分离并培养，慢病毒转染BMSC获取过表达sestrin-2的BMSC，获取过表达sestrin-2的BMSC的细胞培养液，从中提取外泌体。利用BCA法对外泌体进行定量，治疗用量为100μg/ml。方法概述：1.获取骨髓间充质干细胞BMSC，常规方法提取分离并培养，2.pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro-SESN2重组慢病毒转染BMSC以获取过表达sestrin-2的BMSC，3.获取过表达sestrin-2的BMSC的细胞培养液，从中提取外泌体，此外泌体内含有sestrin-2，4.该外泌体用于治疗大鼠的椎间盘退变。一种实验室提取方法为，细胞培养采用干细胞培养基(含10％的无外泌体血清)，收集BMSC的细胞上清液，300g离心10min去除细胞，取上清2000g离心10min去除细胞碎片，取上清继续10000g离心30min去除较大囊泡，最后100000g离心2次各70min，沉淀即为外泌体。sestrin-2蛋白基因名：SESN2SESN2的PCR引物序列forward5′-CAAGCTCGGAATTAATGTGCC-3′reverse5′-CTCACACCATTAAGCATGGAG-3′实验方法与结果：骨髓间充质干细胞(BMSC)提取与鉴定取临床志愿者骨髓10mL至离心管中，1500r/min离心5min。加入红细胞裂解液将红细胞裂解，重复洗涤2次。获取的细胞接种在T25培养瓶中，置于培养箱中培养。细胞传代至第3代，待细胞汇合达80％～90％时，按赛业(CyagenBiosciences)公司脂肪、骨、软骨分化说明书操作完成BMSC三系分化检测(如图1)。构建过表达sestrin-2基因BMSC将已构建成功的sestrin-2基因插入慢病毒包装质粒中，构建pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro-SESN2重组慢病毒包装质粒。将构建成功重组慢病毒包装质粒转染入BMSC中，转染24-48h后经嘌呤霉素筛选后，行Westernblot检测sestrin-2蛋白的表达水平(如图2)。BMSC外泌体提取与鉴定细胞培养采用干细胞培养基(含10％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.骨髓间充质干细胞外泌物在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.骨髓间充质干细胞外泌物在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。


2.骨髓间充质干细胞外泌物在制备预防椎间盘退行性疾病药物中的应用。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在在于：所述椎间盘退行性疾病为椎间盘退变。


4.治疗椎间盘退变的药物，其中，有效成分为骨髓间充质干细胞外泌物。


5.根据权利要求1或2或4所述外泌物，其特征在于：所述外泌物为过表达sestrin2的骨髓间充质干细胞外泌物。


6.根据权利要求1或2或4所述外泌物，其特征在于：所述骨髓间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨操，廖志伟，卢塞登，刘晖，罗荣景，李高才，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42