一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，该纳米疫苗暴露于高温、酶和长期室温环境中仍保持良好的生物活性，显著地提高了疫苗的稳定性，有利于克服疫苗冷链运输问题。本发明专利技术的纳米疫苗能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用于减毒疫苗、蛋白质疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的制备。该纳米疫苗以聚乙二醇为矿化剂，粒径可控，该过程中不涉及有机试剂、微波、高温等剧烈条件，不会对抗原和佐剂的结构和活性造成破坏，并且制备工艺简单、成熟稳定，可以大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法
本专利技术涉及一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，属于生物医药

技术介绍
疫苗接种是预防感染性疾病的重要手段，它能有效地降低各类传染性疾病的感染率和死亡率。但使用过程中存在的诸多问题限制了其更广泛的应用，如对疟疾、艾滋病、肺结核等疾病无效，不能充分地激活免疫系统，需要冷链(coldchain)运输等。其中，世界卫生组织(WHO)已把冷链运输问题确认为疫苗接种面临的最严重的挑战之一。每年用于疫苗的冷链运输的费用大约为2-3亿美元，占整个疫苗项目的80％左右。这不仅增加了疫苗成本和偏远地区人群接种疫苗的难度，而且冷链中断引发的疫苗失活或变性问题严重威胁着公共健康。因此，提高疫苗的稳定性、降低对冷链的依赖对于扩大疫苗的保护范围具有十分重要的意义。近年来，利用纳米颗粒子来传输疫苗是新型疫苗研究的一大热点。纳米粒子应用于疫苗研究具有明显优势，它同时具备疫苗传输功能和免疫佐剂活性，通过调节两方面功能可以增强疫苗的免疫应答能力。另外，纳米疫苗可以使抗原和佐剂到达相同的抗原提呈细胞，产生更加持久的免疫效应。目前，病毒样颗粒、脂质体、聚集体纳米颗粒、乳液、胶束和金纳米颗粒等多种纳米材料已应用到疫苗研究中。纳米疫苗在提高疫苗免疫原性方面已经取得了很大的进展，但是仍存在一些问题：(1)抗原负载量低：虽然可以通过包埋、吸附、偶联等多种方式实现抗原负载，但制备过程复杂繁琐，并且涉及油水界面、机械搅拌、高温、化学反应等剧烈条件，可能会破坏抗原的结构和活性，导致抗原负载量低下；(2)特异性免疫应答弱，例如，诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicT-lymphocyte，CTL)应答；(3)制备过程中使用有毒物质或者有机溶剂，导致生物相容性或生物降解能力较差。金属有机框架(Metal-organicframeworks，MOF)是通过中心金属离子或金属团簇与有机配体自组装形成的一类具有周期性结构的多孔材料。目前，MOF材料多用于气体吸附和催化领域的研究，作为疫苗载体的研究较少，但其在疫苗递送方面具有非常独特的优势：(1)制备方法简单，能够高效封装抗原分子或免疫刺激剂，实现抗原的高负载；(2)促进抗原交叉呈递，基于金属-配体相互作用的MOF在酸性环境中发生解组装，从而实现抗原的可控释放并有利于交叉呈递；(3)生物相容性和可降解性好，可以经过人体代谢系统排出体外；(4)有利于疫苗的储存，克服对冷链的依赖。MOF通过仿生矿化作用可以将生物大分子固定在晶格内，即便在严苛的环境下仍保持其生物活性，并且调控孔径大小、形状等可以实现不同生物大分子的储存。金属有机框架生物安全性高，既可以提高抗原的负载量和特异性免疫应答能力，又有利于抗原的储存，因此在疫苗传输方面具有良好的应用前景。但是MOF材料用于疫苗仍存在着一些关键性问题亟待解决：稳定性差，在体内生理环境下容易降解；装载抗原的过程中往往涉及有机试剂、微波、高温等剧烈条件，很可能会对抗原的结构和活性造成破坏。因此，亟需一种稳定性高，装载抗原无需使用有机试剂等苛刻条件，能够增强疫苗稳定性和免疫原性的新型金属有机框架纳米疫苗。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，该方法可以显著提高疫苗的稳定性和免疫原性，在疫苗传输中具有良好的应用前景。为解决以上问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，包括步骤如下：1)将聚乙二醇、疫苗和2-甲基咪唑溶液在室温下混合均匀，然后加入硝酸锌溶液，得混合液，将混合液搅拌反应；2)将步骤1)反应后的溶液离心分离，然后水洗、除菌，制得疫苗制剂。根据本专利技术优选的，步骤1)中，所述聚乙二醇为矿化剂，聚乙二醇分子量为2-100kDa，为直链、四臂或八臂聚乙二醇，混合液中聚乙二醇的加入量为1-5mg/mL。进一步优选的，步骤1)中，所述聚乙二醇为八臂聚乙二醇，分子量为20-80kDa，聚乙二醇的加入量为2-3mg/mL。根据本专利技术优选的，步骤1)中，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为40-640mmol/L，进一步优选的，2-甲基咪唑溶液的浓度为160mmol/L。根据本专利技术优选的，步骤1)中，所述硝酸锌溶液的浓度为20-80mmol/L，进一步优选的，硝酸锌溶液的浓度为40mmol/L。根据本专利技术优选的，步骤1)中，2-甲基咪唑与硝酸锌的摩尔比为8:1-2:1，进一步优选的，2-甲基咪唑与硝酸锌摩尔比为4:1。根据本专利技术优选的，步骤1)中，所述的疫苗包括疫苗抗原和疫苗佐剂，所述疫苗抗原为蛋白质、多糖、核酸、多肽、多糖结合疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗。进一步优选的，步骤1)中，所述的蛋白质疫苗抗原为鸡卵清蛋白，分子量为43kDa。根据本专利技术优选的，步骤1)中，所述疫苗抗原与聚乙二醇的质量比为1:1-1:10。根据本专利技术优选的，步骤1)中，所述疫苗佐剂为铝盐佐剂、胞嘧啶磷酸鸟嘌呤脱氧寡核苷酸(CpG)、聚肌胞苷酸(poly(I:C))或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。进一步优选的，步骤1)中，所述的疫苗佐剂为胞嘧啶磷酸鸟嘌呤脱氧寡核苷酸(CpG)，混合液中疫苗佐剂加入量为25-150μg/mL。根据本专利技术优选的，步骤1)中，反应温度为4-60℃，反应时间为0.25-2小时，优选的，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-1小时。根据本专利技术优选的，步骤2)中，所述溶液离心分离所用的离心力为5000-10000g，优选的，溶液离心分离所用的离心力为6000-8000g。根据本专利技术优选的，步骤2)中，得到的疫苗制剂中纳米粒子粒径为150-800nm，进一步优选的，疫苗制剂中纳米粒子的粒径为200-400nm。本专利技术的技术特点及优点如下：1、本专利技术的金属有机框架疫苗能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用于减毒疫苗、蛋白质疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的制备，并且显著地提高了疫苗的稳定性，克服了现有疫苗冷链运输的问题，本专利技术的金属有机框架疫苗由于稳定性显著提高，无需冷藏储存。2、本专利技术的金属有机框架纳米疫苗，直接在反应过程中加入疫苗抗原及佐剂一锅法制得，装载过程中不涉及有机试剂、微波、高温等剧烈条件，不会对抗原和佐剂的结构和活性造成破坏，并且制备工艺简单、成熟稳定，可以大规模生产。附图说明图1为实施例1-实施例4制得的封装不同质量抗原的金属有机框架纳米疫苗透射电镜图，A为实施例1的透射电镜图，B为实施例2的透射电镜图，C为实施例3的透射电镜图，D为实施例4的透射电镜图，标尺均为200nm。图2为实施例1-实施例4制得的封装不同质量抗原的金属有机框架疫苗的粒径分布图；A为实施例1的粒径分布图，B为实施例2的粒径分布图，C为实施例3的粒径分布图，D为实施例4的粒径分布图；图3为实施例1-实施例4制得的封装不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，包括步骤如下：/n1)将聚乙二醇、疫苗和2-甲基咪唑溶液在室温下混合均匀，然后加入硝酸锌溶液，得混合液，将混合液搅拌反应；/n2)将步骤1)反应后的溶液离心分离，然后水洗、除菌，制得疫苗制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，包括步骤如下：
1)将聚乙二醇、疫苗和2-甲基咪唑溶液在室温下混合均匀，然后加入硝酸锌溶液，得混合液，将混合液搅拌反应；
2)将步骤1)反应后的溶液离心分离，然后水洗、除菌，制得疫苗制剂。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述聚乙二醇为矿化剂，聚乙二醇分子量为2-100kDa，为直链、四臂或八臂聚乙二醇，混合液中聚乙二醇的加入量为1-5mg/mL；优选的，步骤1)中，所述聚乙二醇为八臂聚乙二醇，分子量为20-80kDa，聚乙二醇的加入量为2-3mg/mL。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为40-640mmol/L，优选的，2-甲基咪唑溶液的浓度为160mmol/L。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述硝酸锌溶液的浓度为20-80mmol/L，优选的，硝酸锌溶液的浓度为40mmol/L。


5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，2-甲基咪唑与硝酸锌的摩尔比为8:1-2:1，优选的，2-甲基咪唑与硝酸锌摩尔比为4:1。

【专利技术属性】
技术研发人员：崔基炜，张贵强，于群，郝京诚，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37