一种肽及体外扩增CIK细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种肽及体外扩增CIK细胞的方法。本发明专利技术实施例的研究结果表明，肽A和肽B可以有效促进CIK细胞体外增殖；同时，本领域技术人员知道，CD3+CD56+细胞是CIK细胞的主要效应细胞，肽A和肽B诱导增殖后的细胞中，CD3+CD56+细胞的比例显著高于常规不含有肽A或肽B的诱导培养方法。CD3+CD56+细胞的比例高决定了相同数量肽A、肽B组细胞在裸鼠体内具有更强的肿瘤杀伤力。因此，肽A和肽B可以用于CIK细胞体外扩增，制备CIK细胞体外扩增试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种肽及体外扩增CIK细胞的方法
本专利技术属于化学生物领域，涉及免疫细胞，具体涉及一种肽及体外扩增CIK细胞的方法。
技术介绍
细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells,CIK)是由CD3+CD56+细胞、CD3+CD56-细胞和一小部分CD3-CD56+细胞组成的异质型细胞群。其中CD3+CD56+细胞是CIK细胞的主要效应细胞，以无非主要组织相容性复合体限制(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)的方式发挥其杀伤肿瘤细胞的活性。临床研究表明以CIK细胞为基础的细胞治疗在很大程度上改善了患者的生存质量、总体生存时间和总生存数，使其备受关注。但是，外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)中CD3+CD56+细胞的含量只有1％～5％，不能满足临床需求(龚子祯等，黄原胶支持CIK细胞高密度扩增，高校化学工程学报，第33卷第1期，2019年2月)。因此需要通过经济有效的方式经体外诱导扩增获得足够数量的CIK细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种肽及体外扩增CIK细胞的方法。本专利技术目的通过如下技术方案实现：一种如下氨基酸序列的肽：GRFTMKSEVAQTRPPQ或GRFTKMSEVAQTRPPQ。上述肽用于体外扩增CIK细胞的用途。上述肽用于制备体外扩增CIK细胞的培养试剂的用途。一种体外扩增CIK细胞的方法，用PBMC人外周血单核细胞进行体外诱导扩增，在培养基中添加含有权利要求1所述序列的肽。有益效果：本专利技术发现，肽A和肽B可以有效促进CIK细胞体外增殖；同时，本领域技术人员知道，CD3+CD56+细胞是CIK细胞的主要效应细胞，肽A和肽B诱导增殖后的细胞中，CD3+CD56+细胞的比例显著高于常规不含有肽A或肽B的诱导培养方法。CD3+CD56+细胞的比例高决定了相同数量肽A、肽B组细胞在裸鼠体内具有更强的肿瘤杀伤力。因此，肽A和肽B可以用于CIK细胞体外扩增，制备CIK细胞体外扩增试剂。附图说明图1为各组细胞增殖倍数；图2为各组CD3+CD56+细胞比例；图3为各组代表性活体成像仪观察到的肿瘤发光影像图；图4为常规组、肽A组和肽B组裸鼠体内肿瘤抑制率。具体实施方式一、实验材料PBMC人外周血单个核细胞购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，冻存发货。RPMI-1640培养液、胎牛血清、AIM-V无血清培养液、人AB血清购自美国Gibco公司。肽A和肽B的氨基酸序列如下所示，采用常规的固相合成法合成，N末端和C末端都没有经过化学修饰，纯度均≥98％：肽A(SequenceNO.1)：GRFTMKSEVAQTRPPQ；肽B(SequenceNO.2)：GRFTKMSEVAQTRPPQ。雄性健康SPF级BALB/c-nu裸鼠购自南京大学模式动物研究所，7～8周龄，体重24～26g。二、实验方法1、PBMC人外周血单核细胞的复苏和传代①提前5分钟准备37摄氏度的无菌水(提前一天准备无菌水1L备用，倒出300mL微波炉稍微加热，调整到37度)；②将PBMC冻存管放入37摄氏度水中，上部分用手捏住，不要让盖缝处浸入水中，摇晃冻存管，尽可能在1分钟内融化细胞(不要超过2分钟，间期时不时拿出看下，待细胞融化到剩下小粒冰状物，停止水浴)；③冻存管离心(900rpm、1min)，管壁喷75％乙醇消毒，待乙醇挥发后，无菌操作吸取上清冻存液体丢弃，补加1mL培养基混匀，加入到培养瓶(T25)接种并补加培养基在37℃、5％CO2条件培养。培养基为含有1％双抗和10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。④细胞培养至密度达80％以上时即可传代。2、分组和体外诱导扩增取传代的PBMC，吸弃培养基，胰酶消化后，用含5％人AB血清的AIM-V培养液重悬制成浓度为1.5×106/mL的细胞悬液，加入终浓度为1000IU/mL的IFN-γ，在37℃、5％CO2条件培养24h后，按如下分组继续培养：常规组：加入终浓度为80μg/L的抗CD3McAb和终浓度为1000IU/mL的rhIL-2继续培养，每2～3d补加含有5％人AB血清、80μg/L抗CD3McAb和1000IU/mLrhIL-2的AIM-V培养液，维持细胞浓度为1.5×106/mL；肽A组：加入终浓度为20μg/mL的肽A、终浓度为80μg/L的抗CD3McAb和终浓度为1000IU/mL的rhIL-2继续培养，每2～3d补加含有5％人AB血清、20μg/mL肽A、80μg/L抗CD3McAb和1000IU/mLrhIL-2的AIM-V培养液，维持细胞浓度为1.5×106/mL；肽B组：加入终浓度为20μg/mL的肽B、终浓度为80μg/L的抗CD3McAb和终浓度为1000IU/mL的rhIL-2继续培养，每2～3d补加含有5％人AB血清、20μg/mL肽B、80μg/L抗CD3McAb和1000IU/mLrhIL-2的AIM-V培养液，维持细胞浓度为1.5×106/mL。3、细胞增殖倍数和CD3+CD56+细胞比例测定继续培养7、14、21d后，用细胞计数法统计培养扩增后的细胞总数，并计算其与初始PBMC数量的比值，该比值即为细胞扩增倍数。CD3+CD56+细胞比例采用流式法测定，具体方法为：收集继续培养7、14、21d后的细胞，PBS洗涤2～3次并重悬，调整细胞浓度为5×106/mL，取100μL细胞悬液于流式细胞仪专用试管中，用FITC-CD3和PE-CD56流式抗体标记细胞，在4℃孵育30min后用流式细胞仪进行细胞表型分析。4、裸鼠移植瘤试验测定细胞体内杀瘤活性取对数生长期HepG2细胞，消化、PBS洗涤，调整细胞浓度为4×107/ml，每只裸鼠一侧背部皮下接种0.2mL。待瘤块长至约80mm3时，随机分为对照组、常规组、肽A组和肽B组，每组5只，并按照如下方法进行处理：对照组：在瘤体周围注射生理盐水；常规组：在瘤体周围注射上述常规组继续培养21d的CIK细胞(5×106个细胞，0.2mL)；肽A组：在瘤体周围注射上述肽A组继续培养21d的CIK细胞(5×106个细胞，0.2mL)；肽B组：在瘤体周围注射上述肽B组继续培养21d的CIK细胞(5×106个细胞，0.2mL)。每3d按照上述方法注射1次，共注射5次。最后1次注射24h后，以活体成像仪观察记录肿瘤发光影像；将裸鼠处死，剥离肿瘤组织，称瘤重，并按照如下公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率(％)＝(对照组瘤均重－CIK细胞组瘤均重)÷对照组瘤均重×100％。5、统计学方法采用SPSS软件进行统计分析。数据以均值±s表示，组间比较采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种如下氨基酸序列的肽：/nGRFTMKSEVAQTRPPQ或GRFTKMSEVAQTRPPQ。/n

【技术特征摘要】
1.一种如下氨基酸序列的肽：
GRFTMKSEVAQTRPPQ或GRFTKMSEVAQTRPPQ。


2.权利要求1所述的肽用于体外扩增CIK细胞的用途。


3.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：单海华，
申请(专利权)人：单海华，
类型：发明
国别省市：江苏;32