化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法技术

本发明专利技术公开了化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法。本发明专利技术具有建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著，对化风丹药母的质量控制具有参考价值，且本发明专利技术建立的方法简单，稳定性好，重复性好，准确度高的特点。

【技术实现步骤摘要】
化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法
本专利技术涉及一种化风丹药母图谱建立及核苷类成分含量测定，特别是一种化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法。
技术介绍
化风丹是由天麻、僵蚕、全蝎、雄黄、药母、麝香、朱砂、硼砂等十多味中药经加工制作而成的中成药。用于风痰闭阻(头痛、耳鸣、脑动脉硬化、肢体麻木无力及脑萎缩)，中风偏瘫，癫痫，面神经麻痹，口眼歪斜等症的治疗，1951年被列入国务院保护的四大名药之一。药母含生川乌、生半夏、生天南星和白附子等中药粉，其制作方法为:将处方中药物粉碎加入牛胆汁混匀后密闭经发酵而成。发酵是经净制或处理后的药物，在一定的温度和湿度条件下，通过霉菌和酶的作用，使药物发泡、生衣的方法。发酵法一直是中药炮制方法之一，它借助微生物的作用，改变中药原有药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。毒剧中药在临床上对某些疑难病症具有较好的疗效，如不经过炮制或炮制不当，不但不能达到治疗疾病的目的，反而还能引起中毒，甚至有生命危险。目前化风丹药母发酵暂无药效成分的检测指标。为了更好控制化风丹药母的质量，确保临床药效，本专利技术提供一种化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，建立不同发酵批次发酵1周化风丹药母的HPLC特征图谱及7种核苷类成分含量测定方法，并比较发酵0、1、2、3、4周后化风丹药母中核苷类成分的含量差异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法。本专利技术具有建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著，对化风丹药母的质量控制具有参考价值，且本专利技术建立的方法简单，稳定性好，重复性好，准确度高的特点。本专利技术的技术方案：化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，包括有以下步骤：(1)发酵样品的制备：药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例：称取白附子28.2g、生川乌28.2g、生半夏28.2g、生天南星28.2g、郁金14.1g、神曲0.14g，加入牛胆汁126.7g搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入恒温恒湿箱中发酵，发酵1周后取样；(2)供试品溶液的配制：取发酵1周后的化风丹药母样品2-4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入15-25mL纯净水，精密称定质量，超声处理25-30min，放冷，用水补足减失质量，离心5-15min，吸取上清液适量用0.4-0.5μm尼龙微孔滤膜过滤即可；(3)混合对照品溶液的配制：混合对照品溶液的配制：精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液，精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.0087mg尿嘧啶、0.0151mg次黄嘌呤、0.0608mg黄嘌呤、0.0152mg尿苷、0.0182mg肌苷、0.0148mg鸟苷、0.0163mg胸苷的混合对照品溶液；(4)色谱条件：采用PntulipsBP-C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～24min100％B；24～48min100～80％B；48～55min，80～100％B；流速：0.8mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μL对照品，20μL样品。前述的化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法中，所述步骤(1)中，是放入温度为35℃，湿度为60％的恒温箱中发酵，发酵1周后取样。前述的化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法中，所述步骤(2)中，取发酵1周后的化风丹药母样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20mL纯净水，精密称定质量，超声处理-功率100W、频率53kHz-30min，放冷，用水补足减失质量，离心-转速20000r/min-10min，吸取上清液适量用0.45μm尼龙微孔滤膜过滤即可。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、建立不同发酵批次化风丹药母的HPLC特征图谱及7种核苷类成分含量测定方法，并比较发酵前后核苷类成分的含量差异。2、方法：以C18色谱柱、甲醇-水梯度洗脱为流动相、流速0.8mL/min、检测波长260nm对12批化风丹药母进行测定，运用指纹图谱相似度评价软件进行评价；并建立化风丹药母中尿嘧啶、次黄嘌呤等7种核苷类成分含量测定，比较发酵0、1、2、3、4周成分含量差异。结果：特征图谱研究中，以黄嘌呤(4号峰)为参照峰，共标定了8个共有峰，不同发酵批次化风丹药母指纹图谱的相似度较低；尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷7种核苷类成分离度好，且方法学考察达到标准；发酵前后化风丹药母7种核苷类成分含量差异较大，通过发酵药母中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤显著增加；尿苷、肌苷和鸟苷显著减少；但7种核苷的总含量显著增加。3、结论：所建立的化风丹药母核苷类指纹图谱特征性强、方法简便，结合7种核苷类成分含量测定可更好控制其质量；化风丹药母发酵对核苷类成分影响显著；本研究对化风丹药母的质量控制具有参考价值。专利技术人进行了大量的实验，以下是部分实验研究实验例：1.仪器与材料1.1仪器高效液相色谱仪岛津LC-20AT(岛津企业管理(中国)有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(邦西仪器科技(上海)有限公司)；盐城凯特TD5B自动脱帽离心机(上海重逢科学仪器有限公司)；ATY224万分之一天平和AUW120D十万分之一天平(日本岛津公司)。1.2材料尿嘧啶(批号：100469-201302，含量99.6％)、次黄嘌呤(批号：140661-201704，含量100％)、黄嘌呤(批号：140662-201606)、尿苷(批号：887-200202)、肌苷(批号：140669-201606)、鸟苷(批号：111977-201501)、胸苷(批号101215-201401)对照品均购自中国食品药品检定研究院；白附子、生川乌、生半夏、生天南星、郁金购自药材市场；色谱甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)，其他试剂为分析纯；12批化风丹药母是按发酵工艺在实验室发酵，编号S1-S12；不同发酵时间化风丹药母编号分别为发酵0周、发酵1周、发酵2周、发酵3周、发酵4周。2.方法与结果2.1发酵样品的制备药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例，称取白附子，生川乌，生半夏，生天南星，郁金，神曲，加入牛胆汁搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入温度为35℃，湿度为60％的恒温箱中发酵。用于建立指纹图谱的药母本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，其特征在于：包括有以下步骤：/n(1)发酵样品的制备：药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例：称取白附子28.2g、生川乌28.2g、生半夏28.2g、生天南星28.2g、郁金14.1g、神曲0.14g，加入牛胆汁126.7g搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入恒温恒湿培养箱中发酵，发酵后取样；/n(2)供试品溶液的配制：取发酵后的化风丹药母样品2-4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入15-25mL纯净水，精密称定质量，超声处理25-30min，放冷，用水补足减失质量，离心5-15min，吸取上清液适量用0.4-0.5μm尼龙微孔滤膜过滤即可；/n(3)混合对照品溶液的配制：混合对照品溶液的配制：精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液，精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.0087mg尿嘧啶、0.0151mg次黄嘌呤、0.0608mg黄嘌呤、0.0152mg尿苷、0.0182mg肌苷、0.0148mg鸟苷、0.0163mg胸苷的混合对照品溶液；/n(4)色谱条件：采用Pntulips BP-C...

【技术特征摘要】
1.化风丹药母特征图谱建立及7种核苷类成分含量测定方法，其特征在于：包括有以下步骤：
(1)发酵样品的制备：药材打粉、过筛后按化风丹处方药物比例：称取白附子28.2g、生川乌28.2g、生半夏28.2g、生天南星28.2g、郁金14.1g、神曲0.14g，加入牛胆汁126.7g搅拌均匀，置于密闭容器内，并放入恒温恒湿培养箱中发酵，发酵后取样；
(2)供试品溶液的配制：取发酵后的化风丹药母样品2-4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入15-25mL纯净水，精密称定质量，超声处理25-30min，放冷，用水补足减失质量，离心5-15min，吸取上清液适量用0.4-0.5μm尼龙微孔滤膜过滤即可；
(3)混合对照品溶液的配制：混合对照品溶液的配制：精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水配置为每1mL含尿嘧啶0.174mg、次黄嘌呤0.151mg、黄嘌呤0.152mg、尿苷0.152mg、肌苷0.182mg、鸟苷0.148mg、胸苷0.163mg的单一对照品母液，精密吸取上述单一对照品母液尿嘧啶0.5mL、次黄嘌呤1mL、黄嘌呤4mL、尿苷1mL、肌苷1mL、鸟苷1mL、胸苷1mL置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得每...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹国琼，张永萍，徐剑，刘耀，
申请(专利权)人：贵州中医药大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52