一种低米氏常数的肌酸脒基水解酶及其制备方法技术

本申请第一方面公开了一种低米氏常数的肌酸脒基水解酶，属于酶工程技术领域；本申请第二方面公开了低米氏常数的肌酸脒基水解酶的制备方法，第三方面本申请还公开了一种包含相关核苷酸序列的重组质粒；本申请通过克隆并实现了肌酸脒基水解酶在大肠杆菌工程菌种进行表达，解决了现有的肌酸脒基水解酶因米氏常数较高，导致应用中检出限较高的问题，同时本申请获得的肌酸脒基水解酶的酶活性较高，为拓宽肌酸脒基水解酶的应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种低米氏常数的肌酸脒基水解酶及其制备方法
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种低米氏常数的肌酸脒基水解酶及其制备方法。
技术介绍
肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶，它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素，进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物，目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液，排出体外。一般来说，血清肌酐的正常范围在35～150μm之间，但当肾功能或肌肉功能出现问题时，肌酐含量会上升至1000μm，血液和尿液中的肌酐含量可以反映肾脏的排泄功能。目前为止检测肌酐含量最常用的是Jaffe化学检测方法和酶比色法。相比之下，由于酶促检测法较高的灵敏度和选择性等特点，日益受到关注。在酶促检测方法中，待测样品通过肌酐水解酶，肌酸脒基水解酶和肌氨酸氧化酶连续转化，最终肌酐被降解为过氧化氢，通过在辣根过氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肌酸脒基水解酶，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种肌酸脒基水解酶，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.如权利要求1所述的肌酸脒基水解酶，其特征在于，如SEQIDNO.2所示的所述核苷酸序列来源于产碱杆菌。


3.一种包含如权利要求1中所述核苷酸序列的重组质粒。


4.一种如权利要求1所述肌酸脒基水解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)肌酸脒基水解酶的挖掘，在NCBI数据库中获得SEQIDNO.2所示的编码肌酸脒基水解酶的所述核苷酸序列；
2)肌酸脒基水解酶的克隆，利用步骤1)中的所述核苷酸序列，合成肌酸咪基水解酶(afCR)的DNA序列(GenBank登录号为BAA88830.1)，构建在pANY1载体上，获得质粒(pANY1-afCR)，将保存的大肠杆菌BL21感受态表达菌株迅速放入冰上至菌体融化，取所述质粒(pANY1-afCR)3-5μl加入感受态中，置于冰上静置25min后，将其置于42℃水浴中进行热机1min，迅速置于冰上2min；取600μl的2×YT培养基加入其中，置于37℃摇床中，220rpm复苏1h，获得构建好的表达菌株，将构建好的所述表达菌株均匀涂布在含有卡那抗性的2×YT培养基上于37℃过夜培养；挑取形态完整的单克隆，接种于10ml含有卡那抗性的2×YT培养基中，置于摇床中，在温度37℃，转速220rpm，培养12h；
3)取步骤2)中克隆后生长状态良好的大肠杆菌BL21菌液接种后在含有卡那抗性的2×YT培养基中培养观察菌液状态，当OD值达到0.8-1.0时，在超净工作台中将0.1‰IPTG加入菌液中进行诱导培养；将完成诱导培养的菌液转移至离心桶，配平置于冷冻离心机中，离心后倒掉上清液，收集菌体为后续实验备用；...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨广宇，白雪，罗漫杰，宗迅成，彭晶，袁秋，
申请(专利权)人：上海瀚诺威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31