一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，包括EnGAM22重组蛋白的制备、动物免疫、杂交瘤细胞的制备和单克隆抗体的制备，EnGAM22重组蛋白免疫小鼠后可产生高效价抗体，制备的杂交瘤细胞株可稳定分泌高性能抗EnGAM22蛋白单克隆抗体。本发明专利技术还公开了一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体，亚型分别为IgG2a、IgG2b，结合能力强、特异性好、效价高。本发明专利技术还公开了EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球虫虫体中的定位，特异性强，准确性好。

【技术实现步骤摘要】
一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗毒害艾美耳球虫配子体EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
鸡球虫病(Coccidiosis)是集约化鸡场最常见的禽病之一，给养鸡业造成巨大的经济损失。毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)是鸡球虫病的主要病原之一，寄生于鸡的小肠中段，引起鸡的急性小肠球虫病，主要危害8～18周龄的青年鸡。近年来随着鸡球虫病活疫苗的推广应用，以及黄羽鸡饲养周期相对较长且常采用地面放养或圈养，使得毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见。因此，迫切需要对该球虫的生物学与分子生物学进行深入研究，发现药物或免疫治疗靶点、或疫苗候选抗原。卵囊是球虫类寄生虫在宿主间传播的重要发育阶段，是由球虫在配子生殖时受精后的大配子发育而成，其囊壁是由位于球虫大配子体成壁体中的蛋白形成，但配子体蛋白形成卵囊壁的分子机制尚不清楚。单克隆抗体具有很高的特异性和灵敏性，与免疫荧光、免疫电镜等技术结合可将目的抗原定位在虫体，是研究寄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将重组菌株pET28a(+)-Engam22/BL21在含有IPTG的LB培养基中诱导培养，超声破碎菌体后将上清用Ni-NTA亲和纯化层析柱纯化并透析复性得到EnGAM22重组蛋白；/n采用EnGAM22重组蛋白注射小鼠体内进行免疫，选择血清抗体效价达到评价标准的小鼠作为免疫小鼠；/n对所述免疫小鼠注射不加佐剂的EnGAM22重组蛋白，取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行多次亚克隆，最终得到能稳定分泌特异性抗EnGAM22蛋白抗体的杂交瘤细胞；/n对BALB/c雌性小鼠注射腹水专...

【技术特征摘要】
1.一种抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组菌株pET28a(+)-Engam22/BL21在含有IPTG的LB培养基中诱导培养，超声破碎菌体后将上清用Ni-NTA亲和纯化层析柱纯化并透析复性得到EnGAM22重组蛋白；
采用EnGAM22重组蛋白注射小鼠体内进行免疫，选择血清抗体效价达到评价标准的小鼠作为免疫小鼠；
对所述免疫小鼠注射不加佐剂的EnGAM22重组蛋白，取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行多次亚克隆，最终得到能稳定分泌特异性抗EnGAM22蛋白抗体的杂交瘤细胞；
对BALB/c雌性小鼠注射腹水专用佐剂，腹腔注射杂交瘤细胞，抽取腹水并纯化得到抗EnGAM22蛋白单克隆抗体。


2.根据权利要求1所述的抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，小鼠免疫的方法为：用浓度为1.8mg/mL的EnGAM22重组蛋白与等体积的QuickAntibody-Mouse3W混合进行腿部肌肉注射；第二周进行二次免疫；第三周眼眶后静脉丛采血测定血清抗体效价。


3.根据权利要求1所述的抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，杂交瘤细胞的制备方法为：对所述免疫小鼠腿部肌肉注射不加佐剂的EnGAM22重组蛋白，三天后取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行三次亚克隆，最终得到能稳定分泌特异性抗EnGAM22蛋白抗体的杂交瘤细胞。


4.根据权利要求1所述的抗EnGAM22蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，单克隆抗体的制备：选取10–12周龄的BALB/c雌性小鼠注射腹水专用佐...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶建平，李文静，刘丹丹，程振扬，徐向东，候照峰，许金俊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32