CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用技术方案

一种CRISPR/Cas的基因工程表达方法，包括通过构建包含表达若干个sgRNA‑tRNA的DNA序列的质粒，快速组建多个引导RNA共表达的元件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRISPR/Cas系统在基因编辑中的应用
本专利技术涉及一种基因编辑系统的DNA表达体系和基因工程的表达方法，尤其涉及CRISPR/Cas9的表达体系及其基因工程的表达方法。背景介绍CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeat)/Cas9技术广泛应用于基因组的定点编辑。对比于其它传统基因编辑工具，诸如锌指(Bibikova et al.Science2003.300:764)，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)(Boch et al.Science 2009.326：1509–1512)，CRISPR/Cas9系统更为简单，易操作。该系统中，Cas9是一种核酸酶，在与单链引导RNA(sgRNA)结合后，可以在其指引下特异地靶向基因组的双链DNA并造成一个双链断裂(DSB)。这种断裂很容易被识别出并通过以下两种机制进行修复：双链的非同源性连接以及同源引导的重组。在以上的修复过程中会发生不同长度的插入和缺失(Indel)以及特异性的序列更改(Cong et al.Science 2013.339：819–823)。核酸酶Cas9之所以能够特异性地靶向DNA是在于它所结合的单链引导RNA(sgRNA)。但如果依赖于一个sgRNA去编辑特定基因，有时会效率不高，而且容易出现等位基因抗性的现象；为了达到对多个基因的高效率编辑，多条不同引导RNA需要同时使用(Ran et al.Cell 2013.154(6):1380–1389)。在这种情况下，Cas9和不同的引导RNA可以在体外预混好，然后导入到细胞或组织中，以便达到多位点编辑的效果(Haoyi et al.Cell 2013.153:1–9)。然而，直接使用Cas9蛋白和sgRNA不仅造价昂贵，而且极大地限制了导入体内的方法，对科研及工业生产都带来极大的不便。Cas9除了蛋白形式，还可以以mRNA或DNA形式转入细胞中，其中mRNA造价非常高。所以以DNA形式转入Cas9表达元件是最为经济有效的方法。另一方面，sgRNA可以以RNA或者DNA的形式转入细胞或组织中。考虑到Cas9是以DNA的形式，如果sgRNA以RNA的形式导入，则极易在Cas9开始表达之前就发生降解，这样当Cas9核酸酶准备好时，可能缺少适用的sgRNA与其配合工作。所以两者都以DNA的形式导入更加符合这个系统的作用模式。同时DNA的递送与病毒包装浸染的模式兼容(Malina et al.Methods Enzymol 2014.546:193-213)，这样可以极大的拓展CRISPR/Cas9在基因组中进行编辑的应用。以DNA的形式通过CRISPR/Cas9系统靶向基因组多位点已经报导过一些方法。如果把多个不同的引导RNA直接串连起来，通过一个启动子进行转录，这样产物中多个引导RNA就将成为一个整体，其编辑效率都比较低。也有通过多个启动子起到多个引导RNA的合成以达到多位点靶向，但这个在材料上难以构建操作；并且引入了多个启动子序列，对于有长度限制的病毒包装是非常不利的；同时多个启动子的活性难以控制一致，对结果造成很多波动(Edward et al.Methods 2015.91:82-86)。如果有一种方法能够在单一启动子控制的转录本里同时表达几个引导RNA，并且在体内可以被精确加工成单个成熟的RNA，这样就可以实现Cas9内切酶多定位编辑的高效性。比如，使用Csy4系统(US 2016/031928 A1)，导入一个特定RNA识别及切割的酶，并在引导RNA的设计中加入特定RNA识别位点，这个系统虽然可以在生物体里作用，但是会造成一些不便，首先这个系统的导入增加生物体的外源DNA的负担，而且加工好的引导RNA比原有结构多出一个RNA识别位点，也是下游反应所不需要的。也有在gRNA序列两端加入可以自切割的ribozyme(核酶)序列(Yangbin et al.JIPB 2014.56：343-349)，这样可以在体内转录后经自切割功能释放出sgRNA，但这种方法受限于ribozyme只能切割一端，这样sgRNA序列两端要连接不同的核酶序列，而且不方便连接多个不同引导RNA对应的DNA片段；还有一个方法就是多个引导RNA通过tRNA进行连接，这样在体内表达后，这个长转录本会经由体内的tRNA加工系统释放出多个不同引导RNA，这个系统经验证在水稻以及果蝇中都是可以正常作用的(US2016/031928 A1)。但是，仍然需要制备更为简单通用的，能在哺乳动物细胞内高效表达的CRISPR/Cas9系统的多基因编辑方法。专利技术简述本专利技术提供了一种在受体细胞中产生多元单链引导RNA(sgRNA)的方法，该方法包括，获得多核苷酸构建体，该构建体包含编码两个或多个sgRNA与tRNA串联单元的DNA序列，将所述构建体引入受体细胞，所述受体细胞的tRNA加工系统在tRNA两端切割该异源多核苷酸，产生单链引导RNA(sgRNA)。优选地，本专利技术的单链引导RNA(sgRNA)是分别针对T细胞受体恒定区基因(TRAC)，组织相容性复合体基因(B2M)，和表皮生长因子受体基因(EGFR)的三个sgRNA。优选地，本专利技术的tRNA是可以形成tRNA特征茎环结构的序列，包括可以转运不同氨基酸的tRNA，以及来源于不同物种的tRNA序列。优选地，本专利技术的受体细胞是哺乳动物细胞，例如293T，K562，Jurkat，Hela细胞等。本专利技术进一步涉及一种在受体细胞中产生多元单链引导RNA(sgRNA)和Cas蛋白的方法，包括表达多元sgRNA元件通用的序列，可变区域的设计指导，以及一步构建的流程方法。本专利技术进一步包括一种核酸构建体，该构建体用于产生多元单链引导RNA(sgRNA)，其包含：编码两个或多个sgRNA与tRNA串联单元的DNA序列。优选地，在每个单链引导RNA的骨架区的末端加入tRNA序列，然后直接串连起来。优选地，以引导RNA的骨架区与tRNA序列融合作为串联单元模板，其中两者连接的区域含有tRNA的前导序列，一般为六个碱基。优选地，以多个引导RNA的特异区来设计引物分别对模板进行扩增以形成串联单元。优选地，以Gibbson连接的方法将串联单元进行顺序组装，连接到启动子之后，更优选地，连接到含启动子序列的线性化质粒中。本专利技术公开了以下序号所示的技术方案：1.一种在细胞内表达CRISPR-Cas体系的方法，包括：(a)构建包含表达(sgRNA-tRNA)n的DNA片段，其中n为1-8之间的整数；(b)将步骤(a)的DNA片段转入细胞内；(c)表达在细胞内的sgRNA与细胞中的Cas蛋白结合，形成CRISPR-Cas体系。2.如技术方案1所述的方法，其中n为1或2或3。3.如技术方案1或2所述的方法，其中步骤(a)中包含表达(sgRNA-tRNA)n的DNA片段为DNA质粒。4.如技术方案1-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在细胞内表达CRISPR-Cas体系的方法，包括：/n(d)构建包含表达(sgRNA-tRNA)n的DNA片段，其中n为1-8之间的整数；/n(e)将步骤(a)的DNA片段转入细胞内；/n(f)表达在细胞内的sgRNA与细胞中的Cas蛋白结合，形成CRISPR-Cas体系。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180327 CN 2018102588196一种在细胞内表达CRISPR-Cas体系的方法，包括：
(d)构建包含表达(sgRNA-tRNA)n的DNA片段，其中n为1-8之间的整数；
(e)将步骤(a)的DNA片段转入细胞内；
(f)表达在细胞内的sgRNA与细胞中的Cas蛋白结合，形成CRISPR-Cas体系。


权利要求1所述的方法，其中n为1或2或3。


权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)中包含表达(sgRNA-tRNA)n的DNA片段为DNA质粒。


权利要求3所述的方法，其中细胞中的Cas蛋白是通过电穿孔转染法进入细胞的；或者是通过构建能表达Cas蛋白的DNA质粒，通过电穿孔转染，脂质体转染或病毒侵染在细胞中表达Cas蛋白。


权利要求4所述的方法，其中表达Cas蛋白的DNA质粒是与步骤(a)的DNA片段属于同一个质粒。


权利要求4所述的方法，其中表达Cas蛋白的DNA质粒与步骤(a)的DNA片段不属于同一个质粒。


前述任一项权利要求所述的方法，其中表达sgRNA的序列为5’-(X)m-恒定区骨架序列-3’，其中X选自A、U、C和G的任一个碱基，m为0-20任一整数，优选m＝17，18，19或20。


前述任一项权利要求所述的方法，其中sgRNA能特异性结合B2M基因、TRAC基因或EGFR基因。


前述任一项权利要求所述的方法，其中tRNA选自人-chr17.tRNA2-6-GlyG...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪沛，牛志杰，林彦妮，
申请(专利权)人：苏州克睿基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32