葡糖淀粉酶工程化酵母和发酵方法技术

本发明专利技术涉及一种工程化酵母，所述工程化酵母包含编码葡糖淀粉酶的外源核酸，所述葡糖淀粉酶包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4或它们的变体。所述工程化酵母能够向发酵培养基中提供葡糖淀粉酶，并引起淀粉材料降解，从而产生葡萄糖以发酵成所需的生物产物，诸如乙醇。可以实现高滴度的生物产物(例如，70g/kg的乙醇)以及低的残余葡萄糖水平。此外，所述酵母在32℃或更高的温度下表现出良好的生长和生物产物产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】葡糖淀粉酶工程化酵母和发酵方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年2月28日提交的名称为“葡糖淀粉酶工程化酵母和发酵方法(GLUCOAMYLASEENGINEEREDYEASTANDFERMENTATIONMETHODS)”的美国临时专利申请号62/636,716的权益，该临时专利申请据此全文以引用方式并入本文。序列表名称为“N00570_Sequence_Listing_ST25.txt”的ASCII文本文件创建于2019年2月27日，大小为123千字节，其全部内容以引用方式并入本文。
本专利技术涉及用外源葡糖淀粉酶核酸工程化的酵母以及用于产生生物产物诸如乙醇的发酵方法。
技术介绍
许多发酵原料来源于植物来源(例如玉米醪)，其中碳水化合物主要为淀粉聚合物的形式。必须将这些原料中的淀粉聚合物处理成低分子量的糖，这些糖可以被酵母消耗并且用于生长和产生生物产物。典型的处理包括酸水解和/或酶促水解，其中聚合物链被水解以产生可以被酵母使用的糖。可以添加淀粉降解酶诸如α淀粉酶和葡糖淀粉酶，以将聚合物转化为简单糖。然而，添加这种酶会显著增加发酵过程的成本和复杂性。在酵母中实现酶的异源表达和功能性以帮助淀粉水解可能具有挑战性，因为很难知道核酸是否将正确表达和功能酶是否将形成，以及酶的活性形式是否将从细胞分泌。工程化酵母以使其在非最佳条件诸如高温下和高生物产物滴度下进行生长和生物产物产生也具有挑战性。例如，虽然通过发酵产生乙醇是众所周知的工业过程，但是在工程化酵母以降低对补充酶的依赖，使其在非最佳条件(例如，温度)下生长的同时保持乙醇速率、滴度和产率，并且使副产物形成最小化在技术上可能存在困难。乙醇浓度增加和不需要的副产物积累也可能对细胞健康不利。
技术实现思路
本专利技术涉及工程化酵母和发酵方法，其中所述工程化酵母能够将异源葡糖淀粉酶(GA)分泌到发酵培养基中并提供对发酵底物的葡糖淀粉酶活性(E.C.3.2.1.3)。本专利技术还涉及通过使用所述工程化酵母进行发酵来产生生物来源的产物诸如乙醇的方法。在一个方面，与本申请相关的实验研究鉴定了真菌葡糖淀粉酶基因，当将所述基因外源引入酵母中时，允许其在含有低葡萄糖和高淀粉量的原料上良好生长，并产生高水平的生物产物。结果表明，所述工程化酵母能够将葡糖淀粉酶分泌到发酵培养基中，并且所述葡糖淀粉酶对淀粉具有酶促活性，以产生足够的葡萄糖用于生长和生物产物产生。与本公开相关的其他益处包括在升高的发酵温度下改善发酵和生物产物产生。与本公开相关的其他益处包括在发酵期结束时减少葡萄糖量。在一个方面，本专利技术提供了一种工程化酵母，所述工程化酵母包含编码葡糖淀粉酶的外源核酸，所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：1(小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)葡糖淀粉酶)具有81％或更高的序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述工程化酵母能够发酵过程中以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0g/L*h或更高的速率产生乙醇。在另一个实施方案中，所述工程化酵母能够在由DE为约50或更小的含葡萄糖聚合物的原料制成的发酵培养基中产生至少70g/kg的乙醇。在另一个实施方案中，所述工程化酵母能够在由DE为约30的含葡萄糖聚合物的原料制成的发酵培养基中产生90g/kg或更多、120g/kg或更多、130g/kg或更多或者140g/kg或更多的乙醇。在实施方案中，可用原料在发酵培养基中在接种48小时内产生70g/kg的乙醇量。在实施方案中，在发酵过程开始(接种)时，发酵培养基中的葡萄糖浓度可不大于5％(重量)。在实施方案中，原料可提供足以在培养基中产生70g/kg的乙醇的含葡萄糖-聚合物的原料，例如约20重量％的葡萄糖聚合物原料。在实施方案中，原料可具有以下一种或多种特性：原料是淀粉水解物；葡萄糖-聚合物主要具有α-1，4键；原料基本上不包括纤维素材料(例如，少于20％、15％或10％的纤维素材料)。在一个实施方案中，所述酵母能够在由DE为30±2的玉米醪制成的发酵培养基中产生至少70g/kg的乙醇，其中所述发酵培养基包含约32干重％的玉米和pH5.8、35ppmCaCl、1900ppm尿素、5ppm氨苄青霉素，其中起始酵母浓度为0.1(OD600)，并且发酵在30℃下搅拌进行48小时。在更具体的实施方案中，所述工程化酵母包含与SEQIDNO：1具有81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的葡糖淀粉酶。在相关的实施方案中，本专利技术提供了一种用于产生生物产物的发酵方法。所述方法包括由含葡萄糖聚合物的原料形成发酵培养基，然后使用工程化酵母发酵所述发酵培养基，所述工程化酵母包含编码葡糖淀粉酶的外源核酸，所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：1具有81％或更高的序列同一性的序列。发酵进行一段时间以产生生物产物，诸如乙醇。在更具体的实施方案中，在发酵期间在发酵培养基中产生量为70g/kg或更大、90g/kg或更大、120g/kg或更大、130g/kg或更大或者140g/kg或更大的乙醇。在一些实施方案中，在所述发酵方法中，含葡萄糖聚合物的原料具有不大于50的右旋糖当量(DE)。在一些实施方案中，葡萄糖不大于原料中固体材料的5重量％。任选地，可以将补充葡糖淀粉酶引入发酵方法中以增加生物产物滴度。在一些实施方案中，使用用与SEQIDNO：1具有81％或更高的序列同一性的葡糖淀粉酶工程化的酵母，发酵在31℃至35℃范围内的温度下进行大部分或全部发酵期。在一些实施方案中，使用用与SEQIDNO：1具有81％或更高的序列同一性的葡糖淀粉酶工程化的酵母，在发酵期结束时，发酵培养基中的葡萄糖浓度不大于1.0g/L。在另一方面，本专利技术提供了一种工程化酵母，所述工程化酵母包含编码葡糖淀粉酶的外源核酸，所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：4(德氏根霉(Rhizopusdelemar)葡糖淀粉酶)具有97％或更高或者98％或更高的序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述工程化酵母能够发酵过程中以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0g/L*h或更高的速率产生乙醇。在另一个实施方案中，所述工程化酵母能够在由DE为约30的含葡萄糖聚合物的原料制成的发酵培养基中产生至少70g/kg的乙醇。在实施方案中，70g/kg的乙醇量可用原料在发酵培养基中在接种48小时内产生。在实施方案中，在发酵过程开始(接种)时，发酵培养基中的葡萄糖浓度可不大于5％(重量)。在实施方案中，原料可提供足以在培养基中产生70g/kg的乙醇的含葡萄糖-聚合物的原料，例如约20重量％的葡萄糖聚合物原料。在实施方案中，原料可具有以下一种或多种特性：原料是淀粉水解物；葡萄糖-聚合物主要具有α-1，4键；原料基本上不包括纤维素材料(例如，少于20％、15％或10％的纤维素材料)。在相关的实施方案中，本专利技术提供了一种用于产生生物产物的发酵方法。所述方法包括由含葡萄糖聚合物的原料形成发酵培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化酵母，所述工程化酵母包含编码葡糖淀粉酶的外源核酸，所述葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO：1具有81％或更高的序列同一性的序列，其中所述酵母能够在发酵过程中以1g/L*h或更高的速率产生乙醇。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180228 US 62/636,7161.一种工程化酵母，所述工程化酵母包含编码葡糖淀粉酶的外源核酸，所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：1具有81％或更高的序列同一性的序列，其中所述酵母能够在发酵过程中以1g/L*h或更高的速率产生乙醇。


2.根据权利要求1所述的工程化酵母，其中所述酵母能够在由(i)DE不大于50的含葡萄糖聚合物的原料制成的发酵培养基中产生(a)至少70g/kg的乙醇。


3.根据权利要求1所述的工程化酵母，其中所述酵母能够在由DE为30+/-2的玉米醪制成的发酵培养基中产生(a)至少70g/kg的乙醇，其中所述发酵培养基包含32干重％的玉米和pH5.8、35ppmCaCl、1900ppm尿素、5ppm氨苄青霉素，其中起始酵母浓度为0.1(OD600)，并且发酵在30℃下搅拌进行48小时。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化酵母，其中所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：1具有85％或更高的序列同一性的序列。


5.根据权利要求4所述的工程化酵母，其中所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：1具有90％或更高的序列同一性的序列。


6.根据权利要求5所述的工程化酵母，其中所述葡糖淀粉酶包含与SEQIDNO：1具有95％或更高的序列同一性的序列。


7.根据前述权利要求中任一项所述的工程化酵母，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯·米勒，布来恩·拉什，布林内·斯坦顿，约书亚·邓恩，
申请(专利权)人：嘉吉公司，
类型：发明
国别省市：美国;US