用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒。本发明专利技术的方法包括分别构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系和第二检测体系的步骤，每种检测体系中分别包含针对不同真菌设计的引物和探针，利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由熔解曲线获得Tm值，并基于Tm值检测样品中的真菌及其类型。本发明专利技术的方法可一次性检测多达12种真菌，大大提高了检测效率和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒
本专利技术涉及皮肤真菌检测领域，具体地涉及用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒。
技术介绍
皮肤癣菌是所有真菌中数量最多、分布最广的一类，能够侵入人和动物的角化组织，感染皮肤、头发和指(趾)甲的角质细胞，是皮肤癣菌病的主要病原体。皮肤癣菌可以分为3个种属：表皮癣菌属、小孢子菌属和毛癣菌属。念珠菌是一种机会致病菌，超过1/4的正常人口腔、消化道、皮肤和生殖道黏膜等部位可检测到念珠菌，白色念珠菌是引起皮肤念珠菌病最常见的病原体，常常引起念珠菌性间擦诊、念珠菌性甲沟炎和甲床炎，以及念珠菌性肉芽肿等。目前传统的鉴定皮肤真菌主要是形态学的方法：显微镜下直接观察和真菌培养。然而，直接镜检缺乏特异性，而真菌培养的周期往往较长，需2-4周。这些限制都可以通过分子诊断技术来解决。目前相对最为先进、也最有发展前景的是分子生物学方法，即PCR，聚合酶链式反应方法。传统的PCR技术虽具有较高的灵敏度，但特异度低，因外源污染等问题容易造成假阳性结果。实时荧光定量PCR技术能够在极短的时间内检测出组织中极微量的真菌DNA，具有较高的灵敏度和特异性。此类技术已被用于检测多种真菌。例如，中国专利申请CN104450936A公开了一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，其独立设计特异性的引物与TaqMan探针，建立一种荧光PCR检测方法能够同时检测15种临床常见致病真菌，其中包括8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。虽然该方法能够同时检测15种真菌，但是并不能区分真菌的具体类型。在中国专利申请CN110551840A中还公开了用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。其中，核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的特定引物和探针。通过这些引物和探针建立了检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌等至少9种侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对上述检测目标基因组同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。然而，该方法的真菌检测种类仍然有限，仍需要能够检测更多数量，并同时检测其具体类型的方法。
技术实现思路
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供能够检测更多真菌的方法和试剂盒。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法，其包括以下步骤：(1)构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系的步骤，其中第一检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；(2)构建用于多通道荧光PCR检测的第二检测体系的步骤，其中第二检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；(3)利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由扩增和熔解曲线获得Ct值和Tm值，并基于Ct值和Tm值检测样品中的真菌及其类型；其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述多通道荧光PCR为四通道荧光PCR，且第一检测体系对应的真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌和紫色毛癣菌；第二检测体系对应的真菌选自苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述第一检测体系或所述第二检测体系中各探针的荧光报告基团不同，且分别选自FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的任意一种，和荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ、Eclipse中的任意一种。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述探针与来源于至少两种真菌基因的Tm值之差为2-10℃。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸组中探针的序列选自SEQIDNo.3、6和9所示的序列，所述第一寡核苷酸组中引物的序列选自SEQIDNo.1-2、4-5、7-8所示的序列。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述第二寡核苷酸组中探针的序列选自SEQIDNo.12、15、18所示的序列，所述第二寡核苷酸组中引物的序列选自SEQIDNo.10-11、13-14和16-17所示的序列。本专利技术第二方面，提供一种用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，该试剂盒被设计为能够用于多通道荧光PCR检测，其包括：用于构建第一检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；用于构建第二检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其中，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于至少两种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于至少两种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其中，所述第一寡核苷酸组中探针的序列选自SEQIDNo.3、6和9所示的序列，所述第一寡核苷酸组中引物的序列选自SEQIDNo.1-2、4-5、7-8所示的序列；和/或所述第二寡核苷酸组中探针的序列选自SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系的步骤，其中第一检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；/n(2)构建用于多通道荧光PCR检测的第二检测体系的步骤，其中第二检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；/n(3)利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由熔解曲线获得Tm值，并基于Tm值检测样品中的真菌类型；/n其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系的步骤，其中第一检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(2)构建用于多通道荧光PCR检测的第二检测体系的步骤，其中第二检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(3)利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由熔解曲线获得Tm值，并基于Tm值检测样品中的真菌类型；
其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多通道荧光PCR为四通道荧光PCR，且第一检测体系对应的真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌和紫色毛癣菌；第二检测体系对应的真菌选自苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一检测体系或所述第二检测体系内各探针的荧光报告基团不同，且分别选自FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的任意一种，和荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ、Eclipse中的任意一种。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或
所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述探针与来源于1到3种真菌基因的Tm值之差为2-10℃。

【专利技术属性】
技术研发人员：程鲁向，朱丽媛，夏小凯，吉斯·丁格曼斯，
申请(专利权)人：上海捷诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31