PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型及其建立方法和应用技术

本发明专利技术属于家畜流行病领域，涉及猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪δ冠状病毒（PDCoV），特别是指PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型及其建立方法和应用。建立方法步骤如下：PDCoV和PEDV毒株的选择；选用5日龄健康仔猪，通过口服途径接种PDCoV毒株和PEDV毒株细胞的混合液；攻毒后每天测量体重、观察临床症状、并通过荧光定量PCR方法分别检测粪便排毒情况和小肠组织中的病毒载量并进行综合评价，建立PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型。本申请成功建立了PDCoV和PEDV共感染仔猪模型，为后续PDCoV与PEDV协同致病机理研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型及其建立方法和应用
本专利技术属于家畜流行病领域，涉及猪δ冠状病毒（PDCoV）与猪流行性腹泻病毒（PEDV），特别是指PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型及其建立方法和应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒（PEDV）可引起仔猪的水样腹泻、呕吐、脱水等临床症状，是引起猪腹泻的重要病原体之一。猪δ冠状病毒（PDCoV）属于δ冠状病毒属，是近年来新被发现的猪肠道冠状病毒，临床上可引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等症状。近年来，中国多省的生猪养殖产业因仔猪死亡而造成的经济损失巨大，经调查显示，大多是因腹泻性病原导致的。有报告显示，近年来我国猪群中存在PDCoV和PEDV共感染现象。Dong等人在对2004~2014年四个不同地区的病料检测中发现PDCoV与PEDV共感染率高达50%。Zhang等人在2015年4月至2018年3月对河南省部分地区采集的430份样品进行检测，发现混合感染率为60.04%。说明PEDV和PDCoV是普遍存在于腹泻猪群中的病毒，是引起仔猪腹泻的重要原因。由于PEDV和PDCoV引起的临床症状十分相似，流行病学和病理变化无明显差别。为了避免误诊，耽误最佳治疗时间，尽管已有研究证明PDCoV和PEDV存在混合感染，但由于PDCoV是近年来新发现的病毒，关于PDCoV与其它病原混合感染的致病性及致病机制都没有进行深入的探究。
技术实现思路
本专利技术提出一种PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型及其建立方法和应用，解决了PDCoV和PEDV这两种病毒的协同致病性状，本申请采用5日龄易感商品仔猪，人工感染PEDVCV777弱毒株和PDCoV-HNZK-02毒株，成功建立了PDCoV和PEDV共感染仔猪模型，为后续PDCoV与PEDV协同致病机理研究奠定了基础。本专利技术的技术方案是这样实现的：PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型的建立方法，步骤如下：（1）PDCoV和PEDV毒株的选择；（2）选用5日龄健康仔猪，通过口服途径接种PDCoV毒株和PEDV毒株细胞的混合液；（3）攻毒后每天测量体重、观察临床症状、并通过荧光定量PCR方法分别检测粪便排毒情况和小肠组织中的病毒载量并进行综合评价，建立PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型。所述步骤（1）中PDCoV毒株为PDCoV-HNZK-02毒株，滴度为1×107TCID50/mL；PEDV毒株为PEDVCV777弱毒株，滴度为2×107TCID50/mL。所述步骤（2）中混合液中PDCoV毒株和PEDV毒株细胞的体积均为5mL。所述步骤（3）中检测PEDV毒株的上游引物序列为5’-CGCAAAGACTGAACCCACTAATTT-3’，下游引物序列为：5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3’；检测PDCoV毒株的上游引物序列为5’-CGTTAACCTCTTCTCACCACTT-3’，下游引物序列为：5’-GCTGAGAGTCTGGTTGGTTATT-3’。上述方式所建立的PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型。上述的共感染仔猪发病模型在研究PDCoV和PEDV毒株共感染发病性状和致病机理中的应用。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术成功建立了PDCoV和PEDV在仔猪体内的共感染发病模型，在构建共感染模型时遇到的技术难点是猪日龄的选择和病毒毒株的选择，以及如何选取攻毒方式才能模拟临床上PDCoV和PEDV共感染致病的真实特征。2、本申请结合PDCoV和PEDV最易感的猪日龄和构建模型的稳定性以及操作是否简便选择5日龄仔猪；由于常规的PEDV流行毒株致病性强容易引起仔猪死亡的特点，而选择PEDVCV777弱毒株进行攻毒；为了真实模拟临床上PDCoV和PEDV共感染致病的特征，选取3种方法进行攻毒：PEDV先感染PDCoV后感染组、PDCoV和PEDV同时感染组、PDCoV先感染PEDV后感染组。3、本申请构建方法的特征在于模拟临床上PDCoV与PEDV共感染的3种情况，通过特定攻毒方法促使仔猪产生临床症状，由图1观察，攻毒后约48小时，PDCoV与PEDV共感染的3组仔猪出现严重腹泻症状，腹泻程度显著高于PEDV单感染组和PDCoV单感染组，且能够显著延长仔猪的腹泻时间。此外，共感染组的仔猪体重在攻毒后与PDCoV和PEDV单独感染组以及对照组相比也有显著降低（p<0.05，见图2）。4、本申请选取临床症状有代表性的PDCoV和PEDV同时攻毒组进行后续试验的分析，通过病理剖检变化、病理组织学变化、粪便排毒情况和小肠中的病毒载量等多项指标对其致病性进行综合评价，多方面分析这两种病原感染的协同致病机制，证实该疾病模型的成功构建，将为这两种病毒共感染相关体内实验研究做进一步的铺垫，也为疫苗免疫效果评价和病毒致病机理的研究奠定一定的基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为攻毒后仔猪腹泻程度变化曲线图。图2为攻毒后各组仔猪体重的测定图。图3为攻毒后各组仔猪肠道剖检变化。图4为攻毒后仔猪肠道组织病理学观察。图5为攻毒后粪便排毒检测。图6为十二指肠、空肠和回肠中的病毒载量。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一、实验材料：细胞和病毒PEDVCV777弱毒株，滴度为2×107TCID50/mL；PDCoV-HNZK-02毒株，滴度为1×107TCID50/mL。本试验所用毒株均来自本实验室分离与保存。二、实验方法1.实验设计选用5日龄健康仔猪30头（PDCoV和PEDV抗体和核酸均为阴性），随机分为6组，每组5头，分别为阴性对照组、PEDV单感染组、PDCoV单感染组、PEDV先感染PDCoV后感染组、PDCoV和PEDV同时感染组、PDCoV先感染PEDV后感染组，通过口服途径进行感染，阴性对照组接种5mL细胞维持液，PEDV单感染组接种5mLPEDVCV777弱毒株细胞毒，PDCoV单感染组接种5mLPDCoV-HNZK-02毒株细胞毒，PDCoV与PEDV混合感染的3组接种5mLPDCoV-HNZK-02和5mLPEDVCV777细胞毒混合液。攻毒后每天测量体重、观察临床症状并打分，攻毒后第1、3、5、7、10、14和21天进行粪便排毒检测。攻毒后3天对各组仔猪进行剖检，观察内脏器官病理变化。此外，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型的建立方法，其特征在于，步骤如下：/n（1）PDCoV和PEDV毒株的选择；/n（2）选用5日龄健康仔猪，通过口服途径接种PDCoV毒株和PEDV毒株细胞的混合液；/n（3）攻毒后每天测量体重、观察临床症状、并通过荧光定量PCR方法分别检测粪便排毒情况和小肠组织中的病毒载量并进行综合评价，建立PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型。/n

【技术特征摘要】
1.PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型的建立方法，其特征在于，步骤如下：
（1）PDCoV和PEDV毒株的选择；
（2）选用5日龄健康仔猪，通过口服途径接种PDCoV毒株和PEDV毒株细胞的混合液；
（3）攻毒后每天测量体重、观察临床症状、并通过荧光定量PCR方法分别检测粪便排毒情况和小肠组织中的病毒载量并进行综合评价，建立PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型。


2.根据权利要求1所述的PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中PDCoV毒株为PDCoV-HNZK-02毒株，滴度为1×107TCID50/mL；PEDV毒株为PEDVCV777弱毒株，滴度为2×107TCID50/mL。


3.根据权利要求1所述的PDCoV和PEDV共感染仔猪发病模型的建立方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红垒，魏战勇，胡慧，郑兰兰，夏璐，韩方方，舒祥力，丁庆文，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41