一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法，先给小鼠连续经食道灌饲药物强的松，再向小鼠腹腔内注射MCMV病毒，并使用分子生物学检测技术鉴定肺部巨细胞病毒潜伏性感染状态。本发明专利技术通过给小鼠口服药物强的松和腹腔内注射MCMV病毒的方法诱导巨细胞病毒发生潜伏性感染，小鼠肺部发生巨细胞病毒潜伏性感染，可以构建出巨细胞病毒潜伏性感染的动物模型，该小鼠模型表现出肺部巨细胞病毒潜伏性感染的典型特征：肺组织出现病毒表达相关蛋白。该模型可应用于巨细胞病毒感染相关领域的科学研究，为探索巨细胞病毒感染的致病机制奠定实验动物基础。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法
本专利技术涉及生物工程
，更具体地，涉及一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法。
技术介绍
人巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)在人群中感染率达到60～100％，其中在我国新生儿中HCMV感染率高达96.2％，其感染率高低与卫生条件、经济状况和地理条件等因素有关。HCMV是疱疹病毒的一种，具有疱疹病毒感染特性，即人体一旦感染病毒将终身携带，并可导致先天性神经系统发育不良、诱发移植器官排斥和减弱免疫防御功能等不良结局，严重威胁生命健康，但是目前治疗和预防措施不多。巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)具有明显的种属特异性，HCMV不能有效感染人以外的实验动物，尤其是鼠类。因此，一直以来众多研究建立以鼠巨细胞病毒(MurineCytomegalovirus，MCMV)感染小鼠为动物模型来模拟HCMV的在体感染过程。目前，具有以下方式构建MCMV毒感染的小鼠模型：(1)显微注射方式经胎盘接种MCMV建立MCMV宫内感染模型；(2)用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠MCMV肝炎模型；(3)异体注射外周血感染MCMV的小鼠模型。另外，胡雪影等(2006)公开了建立HCMV先天性潜伏感染再激活致肝脏损伤的BALB/c老年小鼠模型，是随机将HCMV病毒感染后的老年小鼠进行环磷酰胺激活，建立HCMV潜伏再激活感染鼠模型，用于研究人类HCMV潜伏感染至中老年时期再激活对肝脏损伤(胡雪影，王明丽.人巨细胞病毒先天性潜伏感染再激活致老年小鼠肝脏的损伤[J].世界华人消化杂志，2006，14(12)：1146-1150.)；王宇等(2015)公开了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型的建立，采用BALB/c幼鼠，经右侧耳和眼连线为底边的正三角形的中心将SmithStrainMCMV500PFU/5μL注射进入右侧脑室，培养至16周之后，将脂多糖(LPS)依15μg/kg体重(接近致死量)分别经腹腔和侧脑室内注射，建立了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型(王宇，刘军，刘营营，等.小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型的建立[J].现代生物医学进展，2015(23)：4414-4418.)。但是，目前尚未见有构建肺部潜伏性感染MCMV的实验小鼠模型的相关报道，而且由于器官组织的不同和检测物质的差异，上述现有方法并不适用于肺部MCMV潜伏性感染的建立，而且上述现有方法并未从分子水平上评估MCMV潜伏性感染状态，同时构建时间过短，评估手段少，并不能全面评价MCMV机体组织的影响。因此为深入研究人CMV的致病机制，评估药物抗病毒治疗效果以及进行疫苗研发，亟须建立一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法，先给小鼠连续经食道灌饲药物强的松，再向小鼠腹腔内注射MCMV病毒，并鉴定肺部巨细胞病毒潜伏性感染状态。本专利技术先给小鼠连续经食道灌饲药物强的松，再向小鼠腹腔内注射MCMV病毒，并鉴定肺部巨细胞病毒潜伏性感染状态。本专利技术成功构建肺部CMV潜伏性感染动物模型，尤其是与人类基因组高度同源、经济性良好和繁殖能力强的小鼠MCMV潜伏性感染模型，该实验小鼠模型表现出肺部MCMV潜伏性感染的典型特征：肺组织出现病毒表达相关蛋白。优选地，先给小鼠连续经食道灌饲药物强的松，再向小鼠腹腔内注射MCMV病毒，并鉴定肺部巨细胞病毒潜伏性感染状态。优选地，小鼠需连续经食道灌饲药物强的松7天。优选地，所述经食道灌饲药物强的松的剂量为1mg/kg。优选地，所述MCMV病毒为MCMVSmith病毒株。优选地，所述腹腔内注射MCMV病毒的剂量为5×104PFU。优选地，所述小鼠为6至8周龄的雌性BALB/c小鼠。优选地，是在腹腔内注射MCMV感染小鼠后，继续饲养16周后再鉴定肺部MCMV潜伏性感染状态。优选地，鉴定肺部MCMV潜伏性感染状态是通过聚合酶链式反应，体外空斑实验和聚焦扩增测定方法以确认肺部存在MCMV潜伏性感染，当肺组织中MCMVRNA和1VPA或FEA均为阴性时，表明成功构建潜伏性MCMV感染小鼠，否则失败。进一步优选地，还包括体外空斑实验和聚焦扩增测定方法MCMV。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过连续经食道灌饲药物强的松和腹腔内注射MCMV病毒的方法使实验小鼠肺部发生巨细胞病毒潜伏性感染，可以构建出肺部巨细胞病毒潜伏性感染的动物模型，构建方法新颖，目前还没有这种构建方式。同时本专利技术模型建立方法持续时间长，评估方式全面、系统、准确，较现有巨细胞病毒潜伏性感染动物模型更加准确。附图说明图1为构建小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型流程图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。以下具体实施方式中使用的评价技术：(1)PCR引物设计以下引物用于所有CMV-PCR和RT-PCR反应。利用DNASTAR软件设计引物。小鼠巨细胞病毒DNA聚合酶(＝修复聚合酶)的序列来自GenBank.序列PCR扩增产物的特异性通过使用ABI-PRISM测序器进行确认。(2)引物DNApol：5’-GGGACCCTACTCCGACGACGTG-3’DNApol：3’-GCTCTGCTCTTCGATCGGTAGG-5’(3)PCR用QIAamp组织试剂盒(QIAGENGmbH)从组织中提取DNA。从组织匀浆中提取的DNA在100微升蒸馏水中洗脱，并保存在-20℃直到分析。在总体积为25微升的PCR缓冲液(50mMKCl，20mMTrisHCl[pH8.4]和1.5mMMgCl2)中加入200nM的引物和1.0U的TaqDNA聚合酶(GibcoBRL)扩增DNA。采用以下程序对PerkinElmer9700热循环器进行PCR：94℃初始变性4min，94℃变性35次30s，在53℃退火30s，在72℃下延伸30s，然后在72℃下最终延伸为7min，然后在4℃下保持。以上列出了用于转录DNA聚合酶基因的引物。β-肌动蛋白转录本作为细胞转录对照。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色。(4)RT-PCR和巢式PCR用Trizol试剂从组织中提取RNA，溶于100微升二乙基焦碳酸水中，保存于-80℃。用1UDNaseI在37℃下消化1-5微克RNA进行RT反应20min。在总体积为20微升的情况下进行RT反应，其中含有60mMKCl、15mMTris-HCl(pH8.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法，其特征在于，先给小鼠连续经食道灌饲药物强的松，再向小鼠腹腔内注射MCMV病毒，并鉴定肺部巨细胞病毒潜伏性感染状态。/n

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肺部巨细胞病毒潜伏性感染模型的构建方法，其特征在于，先给小鼠连续经食道灌饲药物强的松，再向小鼠腹腔内注射MCMV病毒，并鉴定肺部巨细胞病毒潜伏性感染状态。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，小鼠需连续经食道灌饲药物强的松7天。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述经食道灌饲药物强的松的剂量为1mg/kg。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述MCMV病毒为MCMVSmith病毒株。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述腹腔内注射MCMV病毒的剂量为5×104PFU。

【专利技术属性】
技术研发人员：张志辉，孙艺凝，
申请(专利权)人：张志辉，
类型：发明
国别省市：广东;44