工程化靶标特异性核酸酶制造技术

本文描述了工程化核酸酶，其包含在切割结构域(例如，FokI或其同源物)和/或DNA结合结构域(锌指蛋白、TALE、单指导RNA)中的突变使得中靶特异性增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化靶标特异性核酸酶相关申请的交叉引用本申请要求以下美国临时申请的权益：2018年2月8日提交的美国临时申请号62/628,016；2018年9月7日提交的美国临时申请号62/728,226；2018年11月12日提交的美国临时申请号62/758,786；2019年1月23日提交的美国临时申请号62/795,937；和2019年2月6日提交的美国临时申请号62/802,092，将所述美国临时申请的披露内容通过引用以其整体特此并入。根据联邦资助的研究作出的专利技术权利声明不适用。序列表本申请含有以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。在2019年2月8日创建的所述ASCII副本命名为8325016940SL.txt并且大小为54,302字节。
本公开文本属于多肽和基因组工程化以及同源重组领域。
技术介绍
人工核酸酶(诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、具有工程化crRNA/tracrRNA(‘单指导RNA’)的CRISPR/Cas系统(也称为RNA指导的核酸酶)、和/或基于Argonaute系统的核酸酶(例如来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为‘TtAgo’)(Swarts等人(2014)Nature507(7491):258-261))包含与切割结构域缔合或可操作地连接的DNA结合结构域(核苷酸或多肽)，并且已经用于基因组序列的靶向改变。例如，核酸酶已被用于插入外源序列、使一个或多个内源基因失活、产生具有改变的基因表达模式的生物体(例如作物)和细胞系。参见例如，美国专利号9,255,250；9,200,266；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和20150056705。例如，核酸酶(例如，锌指核酸酶、TALEN、dCas-Fok融合物)对可以用于切割基因组序列。所述对中的每个成员通常包括与核酸酶的一个或多个切割结构域(或半结构域)连接的工程化(非天然存在的)DNA结合蛋白。当DNA结合蛋白与它们的靶位点结合时，与那些DNA结合蛋白连接的切割结构域被定位成使得可以发生二聚化和随后对基因组的切割。关于锌指蛋白，ZFP对靶DNA序列的特异性取决于锌指结构域与特定DNA碱基之间的序列特异性接触。此外，锌指结构域还包含氨基酸残基，所述氨基酸残基参与跟DNA骨架的磷酸进行的非特异性离子对相互作用。Elrod-Erickson等人((1996)Structure4:1171)通过锌指蛋白和它的同源DNA靶标的共结晶证明，存在特定的氨基酸能够通过形成氢键与DNA骨架上的磷酸相互作用。采用熟知的Zif268骨架的锌指蛋白通常具有一个精氨酸作为它们β折叠的第二链的氨基末端残基，这也是第二个不变半胱氨酸的羧基末端的第二个位置。这个位置在每个锌指结构域内可以被称为(-5)，因为它是α螺旋开始前的第5个残基。这个位置的精氨酸可以经由与其侧链胍基形成带电荷的氢键而与DNA骨架上的磷酸相互作用。Zif268骨架中的锌指蛋白还经常在位于第一个不变半胱氨酸的氨基末端的第4个残基的位置处具有一个赖氨酸。这个位置在每个锌指内可以被称为(-14)，因为它是在锌配位半胱氨酸残基之间具有两个残基的锌指的α螺旋开始前的第14个残基。赖氨酸可以经由与其侧链氨基形成水介导的带电荷的氢键而与DNA骨架上的磷酸相互作用。由于磷酸基团发现于所有DNA骨架上，所以锌指与DNA分子之间的这种类型的相互作用通常被认为是非序列特异性的(J.Miller,MassachusettsInstituteofTechnology博士论文,2002)。为了减少脱靶切割事件，已经开发了工程化的专性异二聚体切割半结构域。参见例如，美国专利号7,914,796；8,034,598；8,961,281和8,623,618；美国专利公开号20080131962和20120040398。这些专性异二聚体仅在不同的工程化切割结构域被ZFP定位在适当的靶位点时才二聚化并切割它们的靶标，从而减少和/或消除单体脱靶切割。为了生产最有效的人工核酸酶，可以探索的另一个领域是在编码人工核酸酶的基因中可能包括的非编码序列中。例如，在mRNA分子中的3’非翻译区(“UTR”)可以在转录后水平上在基因表达调节方面起着重要作用。3’UTR通过mRNA的结构组分与特定的反式作用RNA结合蛋白和非编码RNA之间的精心安排的相互作用来控制mRNA表达(Vislovukh等人(2014)WorldJBiolChem5(1):40-57)，并且还包含多聚腺苷酸化序列。常用的3’UTR的例子包括SV40病毒多聚A片段、牛生长激素(BGH)基因的多聚A区域、和兔β球蛋白UTR(Ludwig,Dale(2006)BioProcessInternational，增刊)。5’UTR在高等真核生物中的长度可以为100-200bp，并且包含高的GC含量(通常>60％)。这些序列可以包括元件(诸如用于核糖体结合的Kozak共有序列和用于帽附接的序列)。高GC含量可以导致复杂的发夹结构(被称为顺式作用调节序列)，其可能影响翻译效率并被称为内部核糖体进入位点(IRES)。5’UTR也可以具有结合用于调节表达的基因特异性调节蛋白(例如铁调节蛋白)的序列，并且还可以在其他功能中发挥作用，所述其他功能诸如提供与翻译机器的相互作用(Araujo等人(2012)CompandFunctGenom(2012)doi:10.1155/2012/475731)。常用的5’UTR序列的例子是β球蛋白5’UTR。UTR还可以在转录后水平上在基因调节的空间控制方面起作用，其通常由3’UTR中的顺式作用元件介导(Mignone等人(2002)GenomeBiol3(3):PMCID:PMC139023)。然而，仍然需要将核酸酶切割系统工程化以提供增强的转录/翻译效率并增加核酸酶活性和/或特异性的另外的方法和组合物。
技术实现思路
本公开文本提供了增加人工核酸酶表达以及增加核酸酶(例如核酸酶对)对其预期靶标的效率(活性)和/或特异性的方法和组合物。因此，本文描述了用于表达人工核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas核酸酶)的多核苷酸(例如，DNA表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种锌指核酸酶(ZFN)，其包含第一ZFN和第二ZFN，所述第一ZFN包含命名为71557的ZFN，并且所述第二ZFN包含命名为71728的ZFN。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180208 US 62/628,016;20180907 US 62/728,226;20181.一种锌指核酸酶(ZFN)，其包含第一ZFN和第二ZFN，所述第一ZFN包含命名为71557的ZFN，并且所述第二ZFN包含命名为71728的ZFN。


2.一种或多种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的第一ZFN和第二ZFN，任选地其中所述一种或多种多核苷酸被携带在AAV载体上。


3.根据权利要求2所述的一种或多种多核苷酸，其中编码所述第一ZFN的第一多核苷酸包含含有如表4所示序列的AAV载体，并且编码所述第二ZFN的第二多核苷酸包含含有如表5所示序列的AAV载体。


4.根据权利要求2或3所述的AAV载体，其中编码所述第一ZFN的所述AAV载体包含SEQIDNO:43所示的序列。


5.根据权利要求2或3所述的AAV载体，其中编码所述第二ZFN的所述AAV载体包含SEQIDNO:56所示的序列。


6.一种细胞，其包含一种或多种根据权利要求1所述的ZFN、根据权利要求2至3中任一项所述的一种或多种多核苷酸、和/或一种或多种根据权利要求4和5所述的AAV载体，所述细胞任选地是干细胞或前体细胞。


7.一种药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求1所述的ZFN、根据权利要求2至3中任一项所述的一种或多种多核苷酸、一种或多种根据权利要求4和5所述的AAV载体和/或一种或多种根据权利要求6所述的细胞。


8.根据前述权利要求中任一项所述的一种或多种ZFN、一种或多种多核苷酸、一种或多种AAV载体、一种或多种细胞和/或一种或多种药物组合物用于切割受试者的内源白蛋白基因的用途。


9.根据权利要求8所述的用途，其还包括向所述受试者给予任选地携带在AAV载体上的供体，使得所述供体被整合到所述受试者的经切割的白蛋白基因中。


10.一种切割受试者细胞中的内源白蛋白基因的方法，所述方法包括向所述受试者给予一种或多种根据权利要求1所述的ZFN、根据权利要求2至3中任一项所述的一种或多种多核苷酸、一种或多种根据权利要求4和5所述的AAV载体、一种或多种根据权利要求6所述的细胞和/或一种或多种根据权利要求7所述的药物组合物。


11.一种试剂盒，其包含一种或多种根据权利要求1所述的ZFN、根据权利要求2至3中任一项所述的一种或多种多核苷酸、一种或多种根据权利要求4和5所述的AAV载体、一种或多种根据权利要求6所述的细胞和/或一种或多种根据权利要求7所述的药物组合物。


12.一种组合物，其包含
(a)编码命名为71557的第一ZFN的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸任选地包含含有如表4或SEQIDNO:43所示的序列的AAV载体；
(b)编码命名为71728的第二ZFN的第二多核苷酸，所述第二多核苷酸任选地包含含有如表5或SEQIDNO:56所示的序列的AAV载体；和
(c)供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包含编码因子IX(FIX)序列的序列。


13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述供体多核苷酸是AAV载体，所述AAV载体包含如表6所示的序列，任选地如SEQIDNO:59所示的序列。


14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和供体多核苷酸被携带在单独的AAV载体上。


15.根据权利要求12至14中任一项所述的组合物用于在有需要的受试者中表达FIX转基因的用途，其中向所述受试者给予所述组合物，使得所述ZFN切割所述受试者中的内源白蛋白基因，所述FIX序列被整合到经切割的白蛋白基因中，并且FIX蛋白在所述受试者中表达。


16.根据权利要求15所述的用途，其中在表达所述FIX蛋白后在所述受试者中治疗血友病。

【专利技术属性】
技术研发人员：R·德克尔弗，I·克里维加，J·C·米勒，张雷，
申请(专利权)人：桑格摩生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US