FAD2基因和突变制造技术

本公开提供了脂肪酸去饱和酶2(FAD2)基因和携带两种或更多种FAD2基因中的一个或多个突变的植物和/或植物细胞；以及制造和使用这种植物的方法。在一些实施方式中，提供了产生具有高油酸含量的种子油的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】FAD2基因和突变相关申请的交叉引用本申请要求于2018年4月4日提交的美国临时申请号62/652,623的权益，其通过引用以其整体并入本文。在ASCII文本文件上提交序列表下述以ASCII文本文件提交的内容以其整体通过引用并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：165072000240SEQLIST.TXT，记录日期：2019年4月4日，大小：42KB)。
本公开涉及与新的植物基因和基因产物有关的组合物和方法，并且也涉及具有一个或多个基因突变的植物。特别地，本公开提供了脂肪酸去饱和酶2(FAD2)基因以及携带FAD2基因中的一个或多个突变的植物和/或植物细胞；以及制造和使用这种植物的方法。在一些实施方式中，植物产生具有高油酸含量的种子油。
技术介绍
Wells，MolBreeding(2014)33:349-362公开了甘蓝型油菜(Brassicanapus)的品系并且叙述了“数个品系具有～6％的PUFA含量和～84％的油酸含量……”。PCT申请WO2014/039692公开了组合物和方法以“在FAD2基因中产生断裂，并且然后公开了将与感兴趣的一个或多个性状相关的核酸分子连接至断裂中”。菜籽油的油酸含量影响菜籽油的烹饪、工业和商业效用。目前，菜籽油一般含有约60％的油酸，这为低于适于许多应用的值。相应地，存在对于具有高油酸含量的种子油的需要，以及对于产生具有高油酸含量的种子油(例如，菜籽油)的改进植物的需要。
技术实现思路
本公开至少部分基于在植物细胞的脂肪酸去饱和酶2(FAD2)基因中具有突变的植物。在某些实施方式中，如本文提供的植物或植物细胞为非转基因的。在某些实施方式中，提供了相对于野生型植物在FAD2基因中具有突变并且种子油中具有更高水平的油酸(18:1Δ9cis)的植物(比如，芸薹属物种(Brassicaspp))。在某些实施方式中，提供了相对于野生型植物在FAD2基因中具有突变并且在种子油中具有降低水平的亚麻油酸(18:2Δ9,12)和亚麻酸(18:3Δ9,12,15)之一或二者的植物(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了相对于野生型植物在FAD2基因中具有突变并且在种子油中具有更高水平的油酸(18:1Δ9cis)和降低水平的亚麻油酸(18:2Δ9,12)和亚麻酸(18:3Δ9,12,15)之一或二者的植物(比如，芸薹属物种)。在任何方面的一些实施方式中和本文提供的实施方式中，植物或植物细胞为非转基因的。在某些方面中，FAD2基因的突变、变更或修饰包括插入或缺失。在一些实施方式中，突变、变更或修饰为或包括核苷酸改变或替换。在方法的一些实施方式中，变更、突变或修饰引入提前终止密码子。在一些实施方式中，变更、突变或修饰引入移码突变。在本文提供的组合物和方法的一些实施方式中，相对于野生型FAD2基因的突变为+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)。在本文提供的组合物和方法的某些实施方式中，相对于野生型FAD2基因的突变为通过靶向突变产生的+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)。在本文提供的方法的一些实施方式中，FAD2基因中的突变、修饰或变更降低或消除FAD2基因的活性或表达。在一些实施方式中，植物或植物细胞为芸薹属植物。如本文使用的脂肪酸去饱和酶2(FAD2)基因意思是具有由如本文公开的甘蓝型油菜FAD2-1序列表示的序列的基因(BnFAD2-1为SEQIDNO:1；BnFAD2-2为SEQIDNO:2；BnFAD2-3为SEQIDNO:3；BnFAD2-4为SEQIDNO:4)，或在某些实施方式中，意思是该基因的同源物、变体或突变体。术语“FAD2同源物”或任何变化指下述FAD2基因或FAD2基因产物：其在另一物种中发现，进行与本文公开的芸薹属基因和基因产物相同或基本上相同的生物功能，并且其中编码区的核酸序列或(FAD2基因产物的)多肽序列被认为与如本文公开的FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3或FAD2-4序列中的一个或多个“相同”或至少50％或至少60％或至少70％或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少92％或至少95％或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％类似(也称为“同一性百分比”或“基本上相同”)。在一个方面中，提供了其中FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3或FAD2-4内源基因中的至少一个具有与任何天然存在的FAD2基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞；在一些实施方式中，提供了其中FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3或FAD2-4内源基因中的至少两个具有与任何天然存在的FAD2基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞；在一些实施方式中，提供了其中FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3或FAD2-4内源基因中的至少三个具有与任何天然存在的FAD2基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞；在一些实施方式中，提供了具有其中FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3和FAD2-4内源基因中的每个具有与任何天然存在的FAD2基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-1内源基因具有与天然存在的FAD2-1基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-1内源基因具有与天然存在的FAD2-1基因相比具有+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)差异的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，如本文提供的植物或植物细胞具有作为通过靶向突变产生的+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)的基因FAD2变更、突变或修饰。在某些实施方式中，如本文提供的植物或植物细胞具有通过靶向突变而产生或发展的FAD2基因变更、突变或修饰。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-2内源基因具有与天然存在的FAD2-2基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-2内源基因具有与天然存在的FAD2-2基因相比具有+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)差异的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-3内源基因具有与天然存在的FAD2-3基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-3内源基因具有与天然存在的FAD2-3基因相比具有+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)差异的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-4内源基因具有与天然存在的FAD2-4基因不同(例如，通过基因变更、突变或修饰)的序列的植物或植物细胞(比如，芸薹属物种)。在某些实施方式中，提供了其中FAD2-4内源基因具有与天然存在的FAD2-4基因相比具有+1、-1、-2核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非转基因植物或植物细胞，其包括具有与任何天然存在的FAD2基因不同的序列的两种FAD2基因，其中所述FAD2基因的差异为各自+1、-1、-2核苷酸

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180404 US 62/652,6231.一种非转基因植物或植物细胞，其包括具有与任何天然存在的FAD2基因不同的序列的两种FAD2基因，其中所述FAD2基因的差异为各自+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)。


2.一种非转基因植物或植物细胞，其包括具有与任何天然存在的FAD2基因不同的序列的三种FAD2基因，其中所述FAD2基因的差异为各自+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)。


3.一种非转基因植物或植物细胞，其包括具有与任何天然存在的FAD2基因不同的序列的四种FAD2基因，其中所述FAD2基因的差异为各自+1、-1、-2核苷酸插入或缺失(InDel)。


4.根据前述权利要求中任一项所述的非转基因植物或植物细胞，其中所述FAD2基因序列差异为靶向突变。


5.根据前述权利要求中任一项所述的植物或植物细胞，其中与相应的野生型全长FAD2蛋白质相比，降低或消除由修饰的或突变的FAD2基因表达的蛋白质的活性或表达。


6.根据前述权利要求中任一项所述的非转基因植物，其中所述植物产生具有至少68％或至少70％或至少72％或至少74％；或至少76％；或至少78％；或至少79％；或至少80％；或至少81％；或至少82％；或至少83％；或至少84％；或至少84％；或至少85％；或至少86％；或至少87％；或至少88％；或至少89％；或至少90％；或至少91％；或至少92％；或至少93％；或至少94％；或至少95％的油酸含量的种子油。


7.根据前述权利要求中任一项所述的非转基因植物，其中所述植物产生具有68％-72％之间；或70％-76％之间；或72％-80％之间；或74％-80％之间；或74％-82％之间；或76％-82％之间；或78％-82％之间；或80％-84％之间；或82％-88％之间；或82％-89％之间；或84％-90％之间；或86％-90％之间的油酸含量的种子油。


8.根据前述权利要求中任一项所述的非转基因植物，其中所述植物产生具有小于18％；或小于16％；或小于15％；或小于14％；或小于13％；或小于12％；或小于10％；或小于9％；或小于8％；或小于7％；或小于6％；或小于5％；或小于4％；或小于3％；或小于2％的亚麻油酸含量的种子油。


9.根据前述权利要求中任一项所述的非转基因植物，其中所述植物产生具有至少68％或至少70％或至少72％或至少74％；或至少76％；或至少78％；或至少79％；或至少80％；或至少81％；或至少82％；或至少83％；或至少84％；或至少84％；或至少85％；或至少86％；或至少87％；或至少88％；或至少89％；或至少90％；或至少91％；或至少92％；或至少93％；或至少94％；或至少95％的油酸含量；和具有小于18％；或小于16％；或小于15％；或小于14％；或小于13％；或小于12％；或小于10％；或小于9％；或小于8％；或小于7％；或小于6％；或小于5％；或小于4％；或小于3％；或小于2％的亚麻油酸含量的种子油。


10.一种方法，所述方法包括在植物或植物细胞的内源基因组FAD2基因中制造靶向突变。


11.一种方法，所述方法包括使细胞接触配置为特异性使内源基因组FAD2基因产生切口或切割内源基因组FAD2基因的DNA切割物。


12.一种方法，所述方法包括使细胞接触配置为特异性使内源基因组FAD2基因产生切口或切割内源基因组FAD2基因的CRISPR、TALEN、锌指或大范围核酸酶。


13.一种在植物细胞中造成基因改变的方法，所述方法包括使所述细胞暴露于编码FAD2基因中的至少一个突变的GRON。


14.一种用于制造包括内源基因组FAD2基因中的突变的植物或植物细胞的方法，所述方法包括：
(1)将具有所述FAD2基因中的靶向突变的基因修复寡核碱基引入至植物细胞中，以产生具有突变体FAD2基因的植物细胞；和
(2)从所述选择的植物细胞再生具有突变的FAD2基因的植物。


15.一种用于在FAD2基因中制造突变的方法，所述方法包括使细胞暴露于DNA切割物。


16.一种用于在FAD2基因中制造突变的方法，所述方法包括使细胞暴露于DNA切割物和GRON。


17.一种用于在FAD2基因中制造突变的方法，所述方法包括使细胞暴露于DNA切割物和GRON，其中用Cy3基团、3PS基团和2’O-甲基中的一种或多种修饰所述GRON。


18.一种植物细胞，所述植物细胞包括DNA切割物和GRON(比如，结合和/或修饰FAD2基因的GRON)，例如，其中所述GRON比如用Cy3基团、3PS基团、2’O-甲基或其他修饰来修饰。在一些实施方式中，所述DNA切割物为选自CRISPR、TALEN、锌指、大范围核酸酶和切割DNA的抗生素中的一种或多种。


19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不包括使所述植物或植物细胞接触任何转基因。


20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中源自所述方法的所述植物为非转基因的。


21.根据前述权利要求中任一项所述的植物或方法，其中所述植物为芸薹属植物、甘蓝型油菜(油菜、芸薹)、芜菁(例如，大头菜、大白菜)、甘蓝(西兰花、卷心菜、花椰菜等)、芥菜型油菜(芥菜)或萝卜(常见小萝卜)，以及许多重要的豆类作物，比如豌豆、大豆、扁豆和黄豆。


22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法产生根据前述权利要求中任一项所述的植物或植物细胞。


23.一种植物或其部分，包括编码脂肪酸去饱和酶2(FAD2)基因的至少两条、至少三条或四条核酸序列中的至少一个突变。


24.根据权利要求23所述的植物或其部分，其中所述核酸序列与选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4组成的组中的核酸序列具有至少90％的同一性、至少95％的序列同一性、至少98％的序列同一性或至少99％的序列同一性。


25.根据权利要求24所述的植物或其部分，其中所述核酸序列选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4组成的组中。


26.根据权利要求23-25中任一项所述的植物或其部分，其中所述突变为移码突变。


27.根据权利要求26所述的植物或其部分，其中与没有所述移码突变的相应的内源基因相比，所述移码突变产生一个或多个核苷酸插入或缺失。


28.根据权利要求26-27中任一项所述的植物或其部分，其中所述移码突变产生提前终止密码子。


29.根据权利要求26-28中任一项所述的植物或其部分，其中所述突变降低或消除所述FAD2基因和/或FAD2多肽的表达。


30.根据权利要求23-29中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物产生包括至少68％、至少70％、至少72％、至少74％、至少76％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的油酸含量的种子油。


31.根据权利要求30所述的植物或其部分，其中所述植物产生包括至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的油酸含量的种子油。


32.根据权利要求23-31中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物产生包括68％-72％之间、70％-76％之间、72％-80％之间、74％-80％之间、74％-82％之间、76％-82％之间、78％-82％之间、80％-84％之间、82％-88％之间、82％-89％之间、84％-90％之间或86％-90％之间的油酸含量的种子油。


33.根据权利要求23-32中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物产生包括小于18％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％或小于2％的亚麻油酸含量的种子油。


34.根据权利要求23-33中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物产生包括至少68％、至少70％、至少72％、至少74％、至少76％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的油酸含量；并且包括小于18％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％或小于2％的亚麻油酸含量的种子油。


35.根据权利要求23-29中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物产生种子并且按所述种子的总脂肪酸含量的重量计，所述种子包括在至少68％、至少70％、至少72％、至少74％、至少76％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·F·W·勾卡尔，M·克努斯，
申请(专利权)人：希博斯美国有限公司，希博斯欧洲有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US