表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用技术

本发明专利技术公开了表达抗CD22嵌合抗原受体和PD‑L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用，涉及医药生物技术领域。表达载体插入有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD‑L1阻断蛋白的第二核酸。利用CD22靶标和PD‑L1靶标，通过靶向CD22的抗体或其片段，本发明专利技术的T细胞可高效、特异性地靶向表达抗原CD22的肿瘤细胞；PD‑L1阻断蛋白可以与内源表达的PD‑1竞争结合靶细胞上的PD‑L1，从而阻断PD‑1/PD‑L1信号通路，延长了本发明专利技术上述T细胞的作用时间，提高了肿瘤杀伤作用，由此缓解了实体瘤对CAR T细胞疗法的免疫耐受性的问题。

【技术实现步骤摘要】
表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
本专利技术涉及医药生物
，具体而言，涉及表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用。
技术介绍
在肿瘤治疗领域，嵌合抗原受体T细胞疗法越来越受到人们的关注。嵌合抗原受体T细胞(CART细胞)是被基因改造而具有嵌合抗原受体的T细胞，用于免疫治疗。嵌合抗原受体(CAR)是一种人工构建的融合基因编码的跨膜分子，可将T细胞特异性靶向癌细胞表面的抗原，以消除靶癌细胞。CAR由胞外结构域(比如，抗体的单链抗体，scFv)、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外结构域的scFv负责特异性抗原的识别。胞内结构域负责信号的传导。当胞外结构域和抗原特异性结合之后，胞内结构域启动细胞活化所需的信号，从而促进T细胞的增殖、细胞因子的释放等。跨膜结构域将胞外结构域和胞内结构域连接。第一代CAR将scFv与胞内信号传导域，比如CD3ζ连接，以诱导抗原特异性T细胞活化。随后的CAR并入单个(第二代)或多个(第三代)其他共刺激信号，比如CD28、4-1BB或OX40的结构域，以进一步增强和维持T细胞的效应子功能。虽然CART细胞免疫疗法具有高靶向性、高杀伤活性等特点，但是由于免疫检查点分子，比如程序性死亡受体-1(PD-1)、细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)等的存在，肿瘤分子可使CART细胞失活，从而逃避CART细胞的杀伤。PD-1是一种重要的免疫抑制分子。PD-1主要表达于T细胞、活化的T细胞、单核细胞和自然杀伤性T细胞(Keir等)中。PD-1的结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内尾部。PD-1属于协同抑制受体，有2个配体，分别为PD-L1和细胞程序性死亡-配体2(PD-L2)。PD-L1在不同的恶性肿瘤，如肺癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和胶质瘤中表达。在体内，PD-1与PD-L1或PD-L2的结合，下调抗原刺激的淋巴细胞增殖以及细胞因子的产生，最终导致淋巴细胞“耗尽”而诱导免疫耐受。实体瘤中的肿瘤细胞可上调PD-L1的表达，继而提供下调活化T细胞的信号，最终关闭免疫反应并诱导免疫耐受性。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了巨大的成功，但在实体瘤中却没有取得成功，克服实体瘤对CART细胞疗法的免疫耐受性，已经成为亟待解决的问题。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用以解决上述技术问题。本专利技术是这样实现的：一种表达载体，表达载体插入有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸；PD-L1阻断蛋白为缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-L1，抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，PD-L1阻断蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。CD22是B细胞的另一种特异性抗原，具有与CD19相似的组织分布。该糖蛋白在B细胞谱系细胞的表面上表达。CD22已被证实是淋巴瘤和B细胞白血病的有希望的靶标。有研究证明靶向CD22的CART实现优异的抗白血病功效。因此，CD22具有作为所有患者的CAR-T细胞疗法的靶标的潜力。对于接受了靶向CD19的CART治疗但不幸康复后复发的患者，它也可以提供第二选择。专利技术人将编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸构建在同一个载体上，同时利用CD22靶标和PD-1靶标，通过靶向CD22的抗体或其片段，本专利技术的T细胞可高效、特异性地靶向表达抗原CD22的肿瘤细胞。PD-L1阻断蛋白仅由PD-1的胞外结构域组成，PD-L1阻断蛋白可以与内源表达的PD-1竞争结合靶细胞上的PD-L1，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路。因此，缓解了实体瘤对CART细胞疗法的免疫耐受性的问题。转染本专利技术提供的表达载体可以得到相应的T细胞，该T细胞可以实现抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的共表达。在肿瘤细胞上表达的PD-L1与本专利技术上述的T细胞表面上表达的PD-L1阻断蛋白结合后，限制了肿瘤细胞上表达的PD-L1与上述T细胞表面上PD-1的结合。由此，减少或甚至阻断了PD-1/PD-L1信号通路。最终，延长了本专利技术上述T细胞的作用时间，提高了肿瘤杀伤作用。本专利技术提供了编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸，在其他实施方式中，并不限于CD22靶点，也可以根据靶向需求选择CD19、CD20，CD30，CD123，BCMA，Her2，GPC3，Mesothelin等其他靶点。在其他实施方式中，对CD22特异的结合结构域(即编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸)还可以是与单链可变片段(scFv)具有至少90％同一性的多肽序列。对CD22特异的结合结构域可以与CD22结合。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述第一核酸的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，第二核酸的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述表达载体为慢病毒表达载体；优选地，慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Zsgreen慢病毒表达载体。在其他实施方式中，慢病毒表达载体也可以根据需要进行自适应选择。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述在表达载体上与第二核酸连接有跨膜结构域；优选地，跨膜结构域选自T细胞受体亚基，CD4，CD8或CD28的跨膜结构域。设置跨膜结构域的目的在于：在细胞的表面表达能力以及相互作用以指导免疫细胞对预定靶标细胞的细胞反应。在其他实施方式中，跨膜结构域可以来源于天然或合成的来源。跨膜结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基如α、β或δ。合成的跨膜结构域可以包含主要是疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述表达载体上还包括：胞外结构域和胞内结构域。胞外结构域包括铰链；胞内结构域包括共刺激信号分子和胞内信号转导结构域；优选地，铰链来自CD8α。铰链用于将跨膜结构域连接到胞外的对CD22特异的结合结构域。在其他实施方式中铰链也可以选自FcRIIIα受体。共刺激信号分子选自人4-1BB的共刺激信号分子、CD27、PD1、ICOS、OX40或B7-H3；胞内信号转导结构域为人CD3ζ信号转导结构域。胞内信号转导结构域负责在胞外的对CD22特异的结合结构域与靶标结合后的胞内信号转导，引起免疫细胞活化和免疫应答。在其他实施例中，胞内信号转导结构域还可以选自CD3γ，CD5或CD3ε。共刺激信号分子是指T细胞上特异性结合共刺激配体从而介导细胞的共刺激应答的关联性结合伴侣。在其他实施例中，共刺激信号分子还可以是CD27、PD1、ICOS、OX40或B7-H3。本专利技术提供的表达载体由编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸(CD22SCFV)、CD8的跨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸；所述PD-L1阻断蛋白为缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-L1，所述抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PD-L1阻断蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸；所述PD-L1阻断蛋白为缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-L1，所述抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述PD-L1阻断蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述第一核酸的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述第二核酸的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体；
优选地，所述慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Zsgreen慢病毒表达载体。


4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，在所述表达载体上，所述第一核酸和所述第二核酸均串联有跨膜结构域；
优选地，所述跨膜结构域选自T细胞受体亚基，CD4，CD8或CD28的跨膜结构域；
优选地，所述T细胞受体亚基为α亚基、β亚基或δ亚基。


5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体上还包括：胞外结构域和胞内结构域；
优选地，所述胞外结构域包括铰链；所述胞内结构域包括共刺激信号分子和胞内信号...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵琦，刘婕，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：澳门;82