一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及两种小RNA miR‑16和miR‑30c联合用于调控神经干细胞增殖。本申请进行了（1）miR‑16和miR‑30c共同作用下使阿尔兹海默病小鼠海马成年神经干细胞数量增加了1.96倍，n=6，

A co expression vector of mir-16 and mir-30c and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用
本专利技术提供一种miR-16和miR-30c联合表达载体，应用于治疗阿尔兹海默干细胞增殖或神经发生，属于生物医药领域。
技术介绍
成年啮齿类和灵长类动物脑内绝大部分神经元没有再生能力，成年神经元发生能力仅局限于位于海马齿状回和侧脑室周围室下区的一部分干性细胞，并且随着年龄的增加，成年神经干细胞的增殖能力不断地降低，特别是近来的研究发现神经性疾病，特别是神经退行性疾病的发生与成年神经的发生能力紧密相关。增强神经发生能力在神经性疾病的诊治上具有重要的应用价值。miR-16在多种肿瘤细胞中具有抑制增殖的作用，并且其还是早期凋亡的诱发因子，能引起细胞的凋亡。miR-30c对细胞增殖发挥正向作用，能够促进神经系统室下区和海马齿状回处的神经发生能力。
技术实现思路
本专利技术提供一种miR-16和miR-30c联合表达载体，通过miR-16和miR-30c作为调控神经干细胞增殖的方法，具体的：本专利技术提供一种miR-16与miR-30c联合表达载体，包含miR-16下调序列与miR-30c过表达序列和质粒载体；所述的miR-16下调序列为miR-16-KD，所述的miR-30过表达序列miR-30c-OE，其编码序列依次为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。其中，所述的质粒载体为pLV-shRNA2载体；所述的表达载体为双启动子表达载体，具体为双启动子慢病毒载体。所述的联合表达载体应用于促进神经干细胞增殖。所述的联合表达载体应用于促进神经发生。所述的联合表达载体作用的神经细胞为室下区神经细胞和海马神经细胞。所述的联合表达载体应用于神经干细胞迁移药物的制备。所述的联合表达载体应用于阿尔兹海默症早期检测试剂的应用。所述的miR-16下调载体是一种与miR-16成熟序列互补的串联8次的海绵载体序列，其可以捕获细胞中成熟的miR-16序列；所述的miR-30c的过表达载体，是一种可以组成型表达的miR-30c的前体序列。本专利技术有益效果我们首次发现了miR-16和miR-30c随发育的进行而产生差异性表达，两者的表达与年龄呈负相关。构建miR-16下调载体和miR-30c的过表达载体,体外转导神经干细胞，发现miR-16下调和miR-30c过表达，神经干细胞增殖增加；利用神经干细胞marker和神经前体marker进行标记，发现抑制miR-16的表达和促进miR-30c的表达可使干细胞保持干性，抑制其向神经前体分化。通过构建能够同时表达miR-16下调序列和miR-30c过表达序列的双启动子慢病毒载体，利用脑立体定位向海马齿状回显微注射该双启动子慢病毒载体，发现室下区和海马齿状回处神经发生分别增加了13.90倍和6.71倍。因此，通过调控miR-16和miR-30c表达情况，能够有效提高阿尔兹海默症小鼠神经干细胞增殖并阻止后续分化，同时，也能提高神经发生，对于早期检测和治疗阿尔兹海默症具有重要意义。附图说明图1miR-16和miR-30c联合作用下，体外神经球的增殖直径检测（a）DAPI染色，显示总体神经形态，标尺，50μm。（b）统计学分析神经球的增殖直径。AD，阿尔兹海默症小鼠组；shRNA，miR-16和miR-30c联合作用组；t值检验，p<0.0001，n=10。图2miR-16和miR-30c联合作用下，体外神经干细胞检测（a）利用GFAP和PH3标记神经干干细胞，进行免疫荧光检测，标尺，50μm。（b）统计学分析体外神经干细胞的数量。AD，阿尔兹海默症小鼠组；shRNA，miR-16和miR-30c联合作用组；t值检验，p=0.023，n=10。图3miR-16和miR-30c联合作用下脑部室下区和海马神经增殖细胞明显增加(a)海马齿状回处神经细胞增殖性检测。shRNA:显微注射有miR-16下调和miR-30c过表达的慢病毒组小鼠；AD，阿尔兹海默病组小鼠（4月龄）；ki67用于标记处于增殖期的细胞；GFAP，胶质纤维酸性蛋白，可以标记神经元干细胞和胶质细胞,标尺，50μm。(b)海马齿状回处神经细胞增殖情况统计结果，t值检验。(c)侧脑室室下区神经细胞增殖性检测，DAPI标记细胞核，标尺，50μm。(d)侧脑室神经细胞增殖情况统计结果，t值检验。p<0.001，n=5。图4miR-16和miR-30c联合作用下神经干细胞数量明显增加(a)脑片免疫荧光检测神经干细胞数量变化，shRNA:显微注射有miR-16下调和miR-30c过表达的慢病毒组小鼠；AD，阿尔兹海默病组小鼠（4月龄）；白色箭头所示为神经干细胞。(b)神经干细胞统计学结果，t值检验，p<0.001，n=6。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术进行详细说明。以下实施方式将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1miR-16和miR-30c联合表达载体的构建实施例1-1pLV-shRNA2双启动子载体的构建（a）利用附表1中的1st-forwardprimer和1st-reverseprimer引物从pSUPER.retro-GFP/Neo载体中扩增H1启动子序列，且通过引物引入XhoI和XbaI限制性酶切识别位点序列，扩增出的序列命名为XhoI-H1-XbaI（见表1)。其中反应混合体系：LATaq(5U/μl)，2μl，10×LATaqbuffer2μl，dNTP(2.5mM)8μl，pSUPER.retro-GFP/Neo质粒500ng，primermixprimermixture(10μM)1μl，ddH2O补足至20μl。热反应体系：95℃预变性5min，94℃30s，57.5℃40s,72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温，60min。（b）利用附表1中的2nd-forwardprimer和2nd-reverseprimer引物，将上述XhoI-H1-XbaI序列两端加上BamHI和EcoRI的识别序列和保护碱基，扩增出的序列命名为BamHI-XhoI-H1-XbaI-EcoRI。其中反应混合体系：LATaq(5U/μl)，2μl，10×LATaqbuffer2μl，dNTP(2.5mM)8μl，（a）扩增产物800ng，primermixprimermixture(10μM)1μl，ddH2O补足至20μl。热反应体系：95℃预变性5min，95℃30s，63.6℃40s,72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温，60min。（c）BamHIandEcoRI内切酶分别酶切pLVX-shRNA2和BamHI-Xho本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miR-16与miR-30c联合表达载体，其特征在于，包含miR-16下调序列与miR-30c过表达序列和质粒载体；所述的miR-16下调序列为miR-16-KD，编码序列为SEQ ID NO: 1，所述的miR-30过表达序列miR-30c-OE，编码序列为SEQ ID NO: 1。/n

【技术特征摘要】
1.一种miR-16与miR-30c联合表达载体，其特征在于，包含miR-16下调序列与miR-30c过表达序列和质粒载体；所述的miR-16下调序列为miR-16-KD，编码序列为SEQIDNO:1，所述的miR-30过表达序列miR-30c-OE，编码序列为SEQIDNO:1。


2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的联合表达载体为双启动子表达载体。


3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述的联合表达载体为pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙婷婷，李天鹏，
申请(专利权)人：枣庄学院，
类型：发明
国别省市：山东;37