一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用技术

本申请提供一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用，所述方法包括培养NK细胞、构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体、将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。本申请制备的NK细胞的细胞特异性表型优秀以及纯度高；其中CD3‑CD56+达到97.13％，CD3‑CD56+CD16+达到93％；携带有CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体的NK细胞能够有效消除肝癌细胞以及抑制肝癌肿瘤体积增加的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用
本申请涉及细胞培养
，尤其涉及一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。自然杀伤细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T及B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。NK的来源主要是靠自体和异源供给，自体NK细胞作用有限，在能够表达HLA(人类白细胞抗原)的癌细胞面前无法发挥杀伤作用，而且人体自身NK细胞数量有限，NK细胞处于不同的发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型及功能均存在很大的差异。以往的异源NK细胞主要是来源于外周血、骨髓、胚胎和胎盘，不仅难收集供者，且由于分离其他免疫细胞的成本极高。这些都限制了NK细胞在临床中上大规模运用。因此，随时可以进行配型的脐血成为了NK细胞的最新来源。由于脐血的复杂性，获得高纯度、高活性的脐血NK一直是大规模应用的障碍。目前，脐血NK细胞培养主要是通过与饲养细胞K562共培养获得；或者是采用磁珠分选及流式分选；再或者是通过诱导干细胞分化。但是上述方法都有明显的缺点。使用饲养细胞无疑引入了外源性的细胞，增加了临床应用的风险；而磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高；而脐带血造血干细胞分化技术尚未成熟。国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和将NK细胞用于癌症治疗方面的研究，但培养得到的NK细胞存在表型较差，纯度较低等问题，不能满足实际应用的需要。
技术实现思路
本申请提供了一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用，以解决在癌症治疗方面上NK细胞存在表型较差、纯度较低以及不能满足实际应用的需要的问题。本申请提供一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：培养NK细胞；构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。可选的，所述培养NK细胞步骤包括：对脐带血取样病毒检测；将检测合格的所述脐带血离心，离心后的脐带血于50-60℃水浴中灭活30-60min；将灭活后的脐带血于-20至-10℃下冷却10-15min后离心，得到上清血浆和下部细胞液；将所述上清血浆分为血浆1和血浆2，将所述血浆1和所述血浆2一同置于4℃冰箱保存备用；向所述下部细胞液加入D-PBS并搅拌均匀，离心去除上清液，得到细胞层；取10-15ml人淋巴细胞分离液加入到所述细胞层中，离心摇匀，去除上清液得到白膜细胞层；向所述白膜细胞层加入培养液并离心，将离心后的所述白膜细胞层加入培养基得到细胞悬液，将所述细胞悬液保存备用；取15-20mlD-PBS与试剂盒因子加入到培养瓶中，所述培养瓶于30-40℃在培养箱包被2-3h后，去除所述培养瓶中的包被液；向去除包被液的培养瓶中加入10ml所述血浆1以及所述细胞悬液，将培养瓶记为培养瓶1。可选的，所述培养NK细胞步骤还包括：配置活化培养基和增殖培养基备用；将培养瓶1放入37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养，以及记为培养第一天；培养第四天向所述培养瓶1中加入30-40ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；培养第六天向所述培养瓶1中加入60-70ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；培养第八天向所述培养瓶1中加入所述血浆2，得到细胞液，将所述细胞液倒入培养袋中，向所述培养袋中加入500ml所述活化培养基；将所述培养袋放入37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；培养第十天将增殖培养基液500ml倒入培养袋中，将所述培养袋放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；培养第十三天向所述培养袋补加所述增殖培养基液1000ml，将所述培养袋放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；培养第十六天收集所述培养袋中的NK细胞悬液，离心得到NK细胞，将所述NK细胞计数封存。可选的，所述构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体的步骤包括：将IgG的前导基因，抗CD16AVL基因，第一链接Linker，抗HSP70VH基因，第二链接Linker，抗HSP70VL基因，第三链接Linker，抗CD16AVH基因，铰链序列基因，hIgG1CH2基因以及hIgG1CH3基因依次连接在一起后得到融合基因；将所述融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体pGreenPuroTM的XbaI/DraIII的位点，即得到CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体。可选的，所述将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞的步骤包括：将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体和包装质粒分别进行高纯度无内毒素抽提；将抽提之后的所述CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体和包装质粒共转染包装细胞；更换所述转染包装细胞的完全培养基以及收集所述转染包装细胞的上清液；对所述上清液进行浓缩病毒以及感染NK细胞，得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体的NK细胞。本申请提供根据上述的方法制备的双特异性抗体NK细胞。本申请还提供根据上述方法制备的双特异性抗体NK细胞在制备治疗肝癌药品中的应用。本申请提供通过基因修饰的NK细胞在体内持续分泌双特异性抗体，继承CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)和双特异性抗体的优点并克服其不足，是一种融合了自体免疫细胞、基因修饰和双特异性抗体的细胞。本申请提供的技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术提供的NK细胞的细胞表型优秀以及纯度高，其中CD3-CD56+达到97.13％，CD3-CD56+CD16+达到93％；携带有CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体的细胞能够有效消除肝癌细胞、抑制肝癌肿瘤体积增加的能力。附图说明为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本申请实施例制备的NK细胞样品1的流式表型检测图；图2为本申请实施例制备的NK细胞样品2的流式表型检测图。具体实施方式下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n培养NK细胞；/n构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；/n将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
培养NK细胞；
构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；
将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养NK细胞的步骤包括：
对脐带血取样病毒检测；
将检测合格的所述脐带血离心，离心后的脐带血于50-60℃水浴中灭活30-60min；
将灭活后的脐带血于-20至-10℃下冷却10-15min后离心，得到上清血浆和下部细胞液；
将所述上清血浆分为血浆1和血浆2，将所述血浆1和所述血浆2一同置于4℃冰箱保存备用；
向所述下部细胞液加入D-PBS并搅拌均匀，离心去除上清液，得到细胞层；
取10-15ml人淋巴细胞分离液加入到所述细胞层中，离心摇匀，去除上清液得到白膜细胞层；
向所述白膜细胞层加入培养液并离心，将离心后的所述白膜细胞层加入培养基得到细胞悬液，将所述细胞悬液保存备用；
取15-20mlD-PBS与试剂盒因子加入到培养瓶中，所述培养瓶于30-40℃在培养箱包被2-3h后，去除所述培养瓶中的包被液；
向去除包被液的培养瓶中加入10ml所述血浆1以及所述细胞悬液，将培养瓶记为培养瓶1。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养NK细胞的步骤还包括：
配置活化培养基和增殖培养基备用；
将培养瓶1放入37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养，以及记为培养第一天；
培养第四天向所述培养瓶1中加入30-40ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；
培养第六天向所述培养瓶1中加入60-70ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；
培养第八天向所述培养瓶1中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬，周晓宇，李陶，张立忠，
申请(专利权)人：中科宝承生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64