一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用技术

本申请提供一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用，所述方法包括培养NK细胞、构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体、将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。本申请制备的NK细胞的细胞特异性表型优秀以及纯度高；其中CD3‑CD56+达到97.13％，CD3‑CD56+CD16+达到93％；携带有CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体的NK细胞能够有效消除肝癌细胞以及抑制肝癌肿瘤体积增加的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用
本申请涉及细胞培养
，尤其涉及一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。自然杀伤细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T及B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。NK的来源主要是靠自体和异源供给，自体NK细胞作用有限，在能够表达HLA(人类白细胞抗原)的癌细胞面前无法发挥杀伤作用，而且人体自身NK细胞数量有限，NK细胞处于不同的发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型及功能均存在很大的差异。以往的异源NK细胞主要是来源于外周血、骨髓、胚胎和胎盘，不仅难收集供者，且由于分离其他免疫细胞的成本极高。这些都限制了NK细胞在临床中上大规模运用。因此，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n培养NK细胞；/n构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；/n将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
培养NK细胞；
构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；
将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养NK细胞的步骤包括：
对脐带血取样病毒检测；
将检测合格的所述脐带血离心，离心后的脐带血于50-60℃水浴中灭活30-60min；
将灭活后的脐带血于-20至-10℃下冷却10-15min后离心，得到上清血浆和下部细胞液；
将所述上清血浆分为血浆1和血浆2，将所述血浆1和所述血浆2一同置于4℃冰箱保存备用；
向所述下部细胞液加入D-PBS并搅拌均匀，离心去除上清液，得到细胞层；
取10-15ml人淋巴细胞分离液加入到所述细胞层中，离心摇匀，去除上清液得到白膜细胞层；
向所述白膜细胞层加入培养液并离心，将离心后的所述白膜细胞层加入培养基得到细胞悬液，将所述细胞悬液保存备用；
取15-20mlD-PBS与试剂盒因子加入到培养瓶中，所述培养瓶于30-40℃在培养箱包被2-3h后，去除所述培养瓶中的包被液；
向去除包被液的培养瓶中加入10ml所述血浆1以及所述细胞悬液，将培养瓶记为培养瓶1。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养NK细胞的步骤还包括：
配置活化培养基和增殖培养基备用；
将培养瓶1放入37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养，以及记为培养第一天；
培养第四天向所述培养瓶1中加入30-40ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；
培养第六天向所述培养瓶1中加入60-70ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；
培养第八天向所述培养瓶1中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬，周晓宇，李陶，张立忠，
申请(专利权)人：中科宝承生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64