一种研究RBM8A基因促进脑胶质母细胞瘤增殖功能的研究方法技术

本发明专利技术涉及了一种研究RBM8A基因促进脑胶质母细胞瘤增殖功能的研究方法。1)Western blot分析胶质母细胞瘤细胞系RBM8A表达，2)慢病毒介导敲除和过表达RBM8A，3)干扰RBM8A基因表达对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响，4)在动物水平，观察敲除RBM8A对胶质母细胞瘤增殖的影响，5)通过Western blot分析检测干扰RBM8A基因表达后的胶质母细胞瘤细胞系中，Notchl、磷酸化STAT3(p‑STAT3)、总STAT3(STAT3)、磷酸化H3(p‑H3)、总H3(H3)和肌动蛋白的情况。Notch/STAT3通路是RBM8A介导的胶质母细胞瘤细胞增殖的机制。本发明专利技术提供了一种胶质母细胞瘤治疗的新思路，为研究胶质母细胞瘤药物治疗靶点提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】
一种研究RBM8A基因促进脑胶质母细胞瘤增殖功能的研究方法
本专利技术属于基因工程
，它涉及一种干扰RBM8A基因表达引起胶质母细胞瘤增殖的分子机制及预警方法。
技术介绍
多形胶质母细胞瘤，又称胶质母细胞瘤，是一种高度恶性的脑肿瘤，预后极差。胶质母细胞瘤的死亡率居高不下，多数患者的五年生存率在3％至9％之间[OmuroA,DeangelisLM.GlioblastomaandOtherMalignantGliomasAClinicalReview[J].JAMATheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,2013,310(17):1842-1850.]。因此识别与胶质母细胞瘤相关的新标记物将有助于早期诊断和治疗胶质母细胞瘤。无义介导的mRNA降解(NMD)途径中关键因子的异常表达与胶质母细胞瘤相关。NMD功能丧失可促进肿瘤生长和侵袭[TheUPF1RNAsurveillancegeneiscommonlymutatedinpancreaticadenosquamouscarcinoma[J].NatureMedicine,2014,20(6):596-598.]，提示靶向NMD途径的关键因子可能对癌症治疗有效[TheUPF1RNAsurveillancegeneiscommonlymutatedinpancreaticadenosquamouscarcinoma[J].NatureMedicine,2014,20(6):596-598.]。RNA结合基序蛋白8A(RBM8A)是一个NMD因子，它也是外显子连接复合物(EJC)的核心因子[Hir,HervéLe,Saulière,WangZ.Theexonjunctioncomplexasanodeofpost-transcriptionalnetworks[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2015.]。EJC在真核生物的转录后调控网络中是一个节点，并且位于1q21.1染色体上的RBM8A基因，在细胞质和细胞核中大量表达[SalicioniAM,XiM,VanderveerLA,etal.IdentificationandStructuralAnalysisofHumanRBM8AandRBM8B:TwoHighlyConservedRNA-BindingMotifProteinsThatInteractwithOVCA1,aCandidateTumorSuppressor[J].Genomics,2000,69(1):0-62.]。它有助于调节RNA转录、翻译、调节细胞周期和凋亡。RBM8A在几种肿瘤中均异常表达，包括宫颈癌、非小细胞肺癌、骨髓瘤和肝细胞癌。并且它还能与转录因子STAT3结合，促进其DNA结合，从而上调靶基因的表达[OhbayashiN,TairaN,KawakamiS,etal.AnRNAbidingprotein,Y14interactswithandmodulatesSTAT3activation[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2008,372(3):0-479.]。然而，RBM8A影响胶质母细胞瘤细胞增殖的机制尚未明确。综上所述，现存在的问题是，我们发现RBM8A能促进胶质母细胞瘤细胞增殖，但是尚无研究分析探索其具体的机制。我们的研究团队以人胶质母细胞瘤系U87-MG和A172为细胞来源，建立了自己的一整套实验技术平台及方法，进一步优化了RBM8A序列设计构建慢病毒质粒的方法，并对鉴定其对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响。通过在CCK-8和EDU实验过程中优化其影响胶质母细胞瘤细胞增殖的功能，取得了可喜的研究成果，为RBM8A应用于基因工程、肿瘤学及在临床上作为胶质母细胞瘤的诊断指标和治疗靶标提供可靠的理论依据。解决现存的问题将会为RBM8A在胶质母细胞瘤进展中的作用提供了新的见解，并有助于确定该疾病的潜在治疗靶点。
技术实现思路
针对现存的技术问题，本专利技术提供了一种影响RBM8A基因表达引起胶质母细胞瘤增殖的分子机制及预警方法。本专利技术是这样实现的，一种影响RBM8A基因表达引起胶质母细胞瘤增殖的分子机制及预警方法包括：第一步：Westernblot分析胶质母细胞瘤细胞系RBM8A表达；第二步：慢病毒介导RBM8A敲除；第三步：慢病毒介导RBM8A过表达；第四步：CCK8和EDU检测在改变RBM8A基因表达后，胶质母细胞瘤细胞的增殖情况；第五步：构建敲除RBM8A胶质母细胞瘤动物模型，MRI检测胶质母细胞瘤肿瘤大小，在动物水平上检测RBM8A敲除对胶质母细胞瘤增殖的影响。第六步：Westernblot分析检测在干扰RBM8A基因表达胶质母细胞瘤细胞系中Notchl、磷酸化STAT3(p-STAT3)、总STAT3(STAT3)、磷酸化H3(p-H3)、总H3(H3)和肌动蛋白的情况，Notch/STAT3通路是RBM8A促进胶质母细胞瘤细胞增殖的机制。Westernblot分析的方法如下：用兔抗人RBM8A抗体和小鼠抗β-肌动蛋白抗体。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解细胞组织。将裂解物样品在8-12％SDS-PAGE凝胶上分离，分离后转移到聚偏氟乙烯膜上。在4℃下与初级抗体孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育。使用ECL试剂盒检测结合抗体。根据引物设计原则，设计3个能够特异敲除RBM8A的引物，RBM8A-shRNA：5‘-AGAGCATTCACAAACAACTGAA-3’(RBM8A-KD1)和5‘-CATCAGCGTTGGTGTGTGT-3’(RBM8A-KD2)。制备重组RBM8A-shRNA慢病毒和阴性对照(NC)慢病毒。在U87-MG细胞中感染敲除RBM8A基因的慢病毒载体，获得稳定感染敲除RBM8A表达的细胞系和对照细胞系。CCK8方法包括：将细胞接种于96孔板中。在不同时间点，向每个孔中加入CCK-8溶液(10μl)，细胞在37℃下孵育2小时。450nm处下测定吸光度。本实验重复3次，按照制造商说明书检测细胞增殖情况。根据制造商的指示进行EDU增殖试验。利用小鼠立体定位技术在6周龄麻醉裸鼠大脑皮层纹状体移植RBM8A-KD或对照-U87-MG细胞的裸鼠模型。通过MRI监测胶质母细胞瘤肿瘤大小。综上所述，本专利技术的优点及积极效果在于：RBM8A被证实是EJC的核心因子，有助于调节RNA转录、翻译、调节细胞周期和凋亡。本专利技术提供一种影响RBM8A基因表达引起胶质母细胞瘤增殖的分子机制及预警方法，明确了抑制RBM8A基因表达能够抑制胶质瘤增殖，从而达到控制肿瘤生长的目的并探索了RBM8A引起胶质母细胞瘤增殖的分子机制。为研究胶质母细胞瘤药物治疗靶点提供了新途径。附图说明图1是本专利技术实施提供的影响RBM8A基因表达引起胶质母细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种研究RBM8A基因促进脑胶质母细胞瘤增殖功能的研究方法，包括以下步骤：/n(1)Westernblot分析胶质母细胞瘤细胞系RBM8A表达。/nWesternblot分析的方法如下：/n用兔抗人RBM8A抗体和小鼠抗β-肌动蛋白抗体。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解细胞组织。将裂解物样品在8-12％SDS-PAGE凝胶上分离，分离后转移到聚偏氟乙烯膜上。在4℃下与初级抗体孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育。使用ECL试剂盒检测结合抗体。/n(2)慢病毒载体介导RBM8A基因敲除，方法如下：/n根据引物设计原则，设计3个能够特异敲除RBM8A的引物，RBM8A-shRNA：5‘-AGAGCATTCACAAACAACTGAA-3’(RBM8A-KD1)和5‘-CATCAGCGTT GGTGTGTGT-3’(RBM8A-KD2)。制备重组RBM8A-shRNA慢病毒和阴性对照(NC)慢病毒。在U87-MG细胞系中感染敲除RBM8A基因的慢病毒载体(RBM8A-KD)，获得稳定感染敲除RBM8A表达的细胞系和对照细胞系。/n(3)慢病毒介导RBM8A过表达，方法如下：/n利用pMSCV-IRES-GFP载体构建标记RBM8A的表达质粒，并将该质粒或相应的空载体(NC)转染293T细胞。通过这些细胞的重组逆转录病毒多重感染感染A172细胞，获得稳定过表达RBM8A基因(RBM8A-OE)的细胞系或对照细胞系。/n(4)检测改变RBM8A表达对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响，方法如下：/n将细胞接种于96孔板中。在不同时间点，向每个孔中加入CCK-8溶液(10μl)，细胞在37℃下孵育2小时。450nm处下测定吸光度。本实验重复进行三次，按照制造商说明书检测细胞增殖情况。/n根据制造商的指示进行EDU增殖试验。/n(5)构建敲除RBM8A小鼠动物模型，在动物水平上检测敲除RBM8A对胶质母细胞瘤增殖的情况，方法如下：/n利用小鼠立体定位技术在6周龄麻醉裸鼠大脑皮层纹状体移植RBM8A-KD或对照-U87-MG细胞的裸鼠模型。通过MRI监测胶质母细胞瘤肿瘤大小。/n(6)通过Westernblot分析检测干扰RBM8A基因表达后的胶质母细胞瘤细胞系中，Notchl、磷酸化STAT3(p-STAT3)、总STAT3(STAT3)、磷酸化H3(p-H3)、总H3(H3)和肌动蛋白的情况。Notch/STAT3通路是RBM8A介导的胶质母细胞瘤细胞增殖的机制。/n...

【技术特征摘要】
1.一种研究RBM8A基因促进脑胶质母细胞瘤增殖功能的研究方法，包括以下步骤：
(1)Westernblot分析胶质母细胞瘤细胞系RBM8A表达。
Westernblot分析的方法如下：
用兔抗人RBM8A抗体和小鼠抗β-肌动蛋白抗体。用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解细胞组织。将裂解物样品在8-12％SDS-PAGE凝胶上分离，分离后转移到聚偏氟乙烯膜上。在4℃下与初级抗体孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育。使用ECL试剂盒检测结合抗体。
(2)慢病毒载体介导RBM8A基因敲除，方法如下：
根据引物设计原则，设计3个能够特异敲除RBM8A的引物，RBM8A-shRNA：5‘-AGAGCATTCACAAACAACTGAA-3’(RBM8A-KD1)和5‘-CATCAGCGTTGGTGTGTGT-3’(RBM8A-KD2)。制备重组RBM8A-shRNA慢病毒和阴性对照(NC)慢病毒。在U87-MG细胞系中感染敲除RBM8A基因的慢病毒载体(RBM8A-KD)，获得稳定感染敲除RBM8A表达的细胞系和对照细胞系。
(3)慢病毒介导RBM8A过表达，方法如下：
利用pMSCV-IRES-GFP载体构建标...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹东华，林燕，徐宁，王浩，李荣杰，覃刚，胡北泉，
申请(专利权)人：南宁市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：广西;45