一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用。本发明专利技术阐明了国际上多年未能探明的植物转运除草剂的抗性机理，发掘了新的除草剂抗性基因资源转运蛋白基因ABCC8，基于新功能基因培育了新的抗除草剂作物种质材料，为我国抗除草剂转基因作物新品种的培育提供了保障。

【技术实现步骤摘要】
一种抗除草剂基因及其构建的载体、表达的多肽和基因的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体的说，涉及抗除草剂基因及其构建的载体、编码的蛋白质，以及利用该基因在抗除草剂转基因植物研制方面的应用。这种基因可以用来在植物中表达而使植物获得对除草剂的抗性能力，从而可以利用除草剂选择性地防除杂草。
技术介绍
草甘膦(glyphosate)是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。草甘膦是一种内吸传导型除草剂，喷洒于植物茎叶后，即可被植物吸收，并迅速输导到整个植株及其根部，从而杀灭杂草，不仅能杀死地上部分，并且能作用于根部，正做到斩草除根，可有效防除那些靠根系繁殖的多年生杂草。然而作为一种非选择型除草剂，其杀灭杂草的同时，对农作物同样具有灭生性，一定程度上限制了其使用范围和使用时间。因此，培育具有草甘膦抗性的农作物具有重要意义，不仅可有效防控杂草而且可减少农业生产费用。草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被分离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensspCP4)和SalmonellatyphimuriumCT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用(美国专利453590,4769061,5094945)。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的转基因抗草甘膦植物。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂(农达)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用。草甘膦抗性基因的来源主要有2种，一是通过筛选抗草甘膦物种，从而克隆得草甘膦抗性基因。目前，已在微生物Salmonellatyphimurium、AgrobacteriumtumefaciensspCP4、Achromobactersp.LBAA和Pseudomonassp.PG2982等中发现了具有抗性的EPSPS基因，其中部分基因已在部分作物中已批准商业化生产。二是对EPSPS基因突变，获得草甘膦抗性突变体，如已商业化生产的抗草甘膦玉米GA21中抗性基因是利用位点突变后克隆获得的。ABC转运蛋白(ATP-bindingcassettetransporters，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白)超家族作为最大跨膜蛋白家族，广泛存在于从低等的古细菌到人类在内的所有生物体中。最早于1976年在人类肿瘤的研究中首次提出了基于ABC转运蛋白的多药抗性MDR(multidrugresistance)的概念，引起了医学研究领域的广泛关注。后续研究证实ABC转运蛋白在癌变或正常器官和组织中均参与药物以及内外源化合物的吸收、分布和排泄，因此被认为是参与内外源物质解毒作用的重要蛋白酶家族。近年来，随着人类和哺乳动物ABC转运蛋白的深入研究，越来越多的体内体外实验证实多抗蛋白基因可以介导多种结构不相关药剂的转运。此发现受到了农药研究学者的广泛关注，迄今为止，ABC转运蛋白已被证实与大量不同种类的化学药剂的转运或抗性相关。而能够转运除草剂(包括草甘膦)并导致抗性的ABC转运蛋白尚未被发现。本专利技术首先发现了抗草甘膦稗草品种，然后利用其基因组序列的信息克隆了其ABC转运蛋白基因ABCC8，并且进一步在水稻、玉米和大豆中证明了ABCC8基因的抗草甘膦能力及其在发展转基因抗草甘膦农作物中的用途。而本专利技术涉及的利用全新转运蛋白基因ABCC8来实现植物抗除草剂草甘膦从未有人报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种在植物中能高效表达的抗除草剂基因。该基因为ABC转运蛋白基因ABCC8。基因的核苷酸序列包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示，以及与SEQIDNO:1所示序列具有不小于71％相同性的序列中的任意一条。本专利技术所述的除草剂包括草甘膦。除了草甘膦，可能还有其他除草剂可以被转运蛋白以类似的方式去除从而让植物产生抗性。本专利技术的抗除草剂基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于：1)利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽；2)通过导入核苷酸序列的变异但是仍然编码具有抗除草剂能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。利用本专利技术提供的核苷酸序列，也可以获得具有相同功能的同源基因。一种方法是利用本专利技术提供的核酸为探针杂交DNA文库获得同源基因，另一种方法是根据本专利技术提供的核酸序列设计引物通过PCR而克隆同源基因。不仅如此，本领域的技术人员还利用本专利技术提供的核酸序列和蛋白质序列，通过分子信息学的方法从基因组库中找出高同源性的基因。如利用BLAST(www.ncbi.nih.gov)方法，根据本专利技术提供的核苷酸序列和蛋白质多肽的氨基酸序列，发现与本专利技术提供的基因同源性比较高的基因。本专利技术的第二个目的是提供上述的抗除草剂基因编码的多肽。所述的多肽的氨基酸序列包括SEQIDNO:5(即EcABCC8基因编码的多肽)所示，或者与SEQIDNO:5所示序列具有不小于70％相同性的序列。这种蛋白质在植物细胞中能提高细胞的抗除草剂(例如草甘膦)的能力。通常与本专利技术的抗除草剂基因EcABCC8至少有71％，77％，87％的相同性的核苷酸序列表达的蛋白质可能具有抗草甘膦的活性，并且可以通过现在已有的方法进行确定，如利用本专利技术实施例4、5、6的方法。本专利技术的第三个目的是提供表达上述抗除草剂基因的表达载体，该载体包含上述的抗除草剂基因序列。所述的表达载体，还包含在植物中表达上述的抗除草剂基因所需要的其他元器件。利用本专利技术提供的抗除草剂基因核苷酸序列，可以构建能够在植物中表达的人工基因。同样，根据本专利技术提供的抗除草剂蛋白质多肽序列，也可以人工合成核酸序列，并进一步构建能够在植物中表达的人工基因。能够在植物中表达的人工基因构件包括启动子、抗除草剂基因和终止子。例如，在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin-1启动子，或者水稻Actin启动子；而终止子可以是根癌农杆菌终止子(Nos)或者其他终止子。该表达构件可以通过农杆菌(如Agrobacterium菌株)、基因枪方法或者其他方法整合到植物的基因组中，然后用1-5mM的除草剂，如草甘膦培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗除草剂基因，为ABC转运蛋白基因ABCC8。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗除草剂基因，为ABC转运蛋白基因ABCC8。


2.根据权利要求1所述的抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示，以及与SEQIDNO:1所示序列具有不小于71％相同性的序列中的任意一条。


3.根据权利要求1所述的抗除草剂基因，其特征在于，所述的除草剂包括草甘膦。


4.权利要求1或2或3所述的抗除草剂基因编码的多肽。


5.一种抗除草剂基因表达载体，其特征在于，包含权利要求1或2或...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏连阳，潘浪，李祖任，王军志，陈文，刘浩哲，
申请(专利权)人：湖南省农业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43