绿豆抗白粉病基因VrMOL12及其应用制造技术

本发明专利技术公开了绿豆抗白粉病基因VrMOL12及其应用。一种绿豆抗白粉病基因VrMOL12，选自以下任意一项：1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的基因，2)具有SEQ ID NO.2所示CDS序列的基因；3)与1)、2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明专利技术首次鉴定了绿豆抗白粉病基因VrMOL12，对绿豆抗白粉病育种工作具有重要意义，通过育种手段可有效控制绿豆白粉病的发生，减轻该病害造成的经济损失，并为绿豆抗白粉病的分子育种提供新的基因资源。

【技术实现步骤摘要】
绿豆抗白粉病基因VrMOL12及其应用
本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及绿豆抗白粉病基因VrMOL12及其应用。
技术介绍
绿豆(Vignaradiata)是一种豆科、蝶形花亚科豇豆属植物，是亚洲，特别是南亚和东南亚的一种重要的社会经济作物。广泛种植于印度、中国、缅甸、泰国、孟加拉国、巴基斯坦、柬埔寨、印度尼西亚、菲律宾和澳大利亚。绿豆通常是继水稻、小麦和玉米之后单独种植的作物，或作为各种种植系统的组成部分，如与甘蔗的间作，因为绿豆生长快，成熟早，只有75天左右。据估计，绿豆的生产面积超过600万公顷。印度、缅甸和中国是主要种植国家。绿豆的平均产量不高。病害是造成低产量的主要原因之一。侵染绿豆的常见病害包括白粉病、叶斑病和病毒病等。绿豆白粉病是由蓼白粉菌(ErysiphepolygoniD.C.)引起的。它是生长在热带和亚热带地区的绿豆的一种主要真菌病，尤其是在阴干季节。冷季是南亚和东南亚一些国家生产优质绿豆的主要季节。白粉病可导致感病品种产量损失20～40％。如果该病害发生在生长早期，且天气适宜，则可杀死绿豆幼苗，造成绝产。白粉病防治最常用的方法是喷洒杀菌剂。因此选育抗白粉病绿豆品种对我国绿豆产业有很大的益处。MLO基因在大麦中被证实是白粉病发病的重要条件(Buschgesetal.1997).另外在水稻(OryzasativaL.；OsMLO3),小麦(TriticumaestivumL.；TaMLO_A1和TaMLO_B1)拟南芥(AtMLO2,AtMLO6和AtMLO12),番茄(SolanumlycopersicumL.；SlMLO1),辣椒(CapsicumannuumL.；CaMLO2),豌豆(PisumsativumL.；PsMLO1),烟草(NicotianatabacumL.；NtMLO1),荷花(Lotusjaponicus(Regel)K.Larsen；LjMLO1)和三叶草(MedicagotruncatulaGaertn.；MtMLO1)(Baietal2008；Zhengetal.2013；Consonnietal.,2006；Humphryetal.2011；Pavanetal.2011).等植物上都有相关基因报道。绿豆MOL基因也有近期报道，但是关于该类基因在抗病品种和感病品种中的差异，至今未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供绿豆抗白粉病基因VrMOL12及其应用。一种绿豆抗白粉病基因VrMOL12，选自以下任意一项：1)具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的基因，2)具有SEQIDNO.2所示CDS序列的基因；3)与1)、2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。利用图位克隆方法对其进行精细定位，基因VrMOL12位于绿豆第9号染色体9,989,729到9,995,549之间约6kb范围内。RUM5来自泰国，已有文献报道其抗绿豆白粉病。KPS1和CN60已有文章报道其感白粉病，VC1973A为已公开测序品种(http://plantgenomics.snu.ac.kr/mediawiki-1.21.3/index.php/Main_Page)，为了明确绿豆抗白粉病品种RUM5的抗白粉病基因，本专利技术对绿豆RUM5的抗白粉病基因VrMOL12进行了克隆和测序。序列分析结果显示，抗白粉病品种RUM5中的VrMOL12基因与感白粉病品种KPS1和CN60有多处明显差异，碱基差异能引起VrMOL12蛋白功能的变化。感白粉病品种KPS1基因序列如SEQIDNO.3所示，感白粉病品种CN60基因序列如SEQIDNO.4所示。在6个外显子中，有12个SNP位点能用于判断白粉病的抗感性，其中引起氨基酸变化的位点有348(丙氨酸(A)→甘氨酸(G)，387(丙氨酸(A)→丝氨酸(S)和476(丙氨酸(A)→甘氨酸(G)。本专利技术还提供表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌，其包括包含基因VrMOL12序列的核酸。本专利技术还提供基因VrMOL12在提高转基因绿豆抗白粉病能力中的应用。其中，所述植物包括绿豆。本专利技术还提供一种转基因植物的构建方法，利用基因工程手段，在目标植物中影响基因VrMOL12的表达量，筛选阳性转基因植株。有益效果：本专利技术首次鉴定了绿豆抗白粉病基因VrMOL12，对绿豆抗白粉病育种工作具有重要意义，通过育种手段可有效控制绿豆白粉病的发生，减轻该病害造成的经济损失，并为绿豆抗白粉病的分子育种提供新的基因资源。附图说明图1RUM5中抗白粉病基因VrMOL12的精细定位图具体实施方式实施例1以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1CN60XRUM5F2群体190株，CN60XRUM5的BC1F1群体74株，群体构建及表型鉴定以抗白粉病绿豆野生资源RUM5为父本，以感白粉病绿豆资源CN60为母本，配制杂种，构建了包含190个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系，进行抗白粉病鉴定。此外以抗白粉病绿豆野生资源RUM5为父本，以感白粉病绿豆资源CN60为母本，配制杂种，构建了包含74个单株的BC1F1分离群体，每个单株自交获得BC1F1：2家系，进行抗白粉病鉴定，两个群体同步试验，具体方法如下：每份材料随机选取30粒健康种子，包括2份感白粉病CN60、抗白粉病RUM5对照，种于田间，行距50cm，株距12cm，出苗后20d，25d和30d分别对叶片进行白粉病接种，待出苗后50d时统计，每株叶片上的侵染按1～9(1＝无病害侵染，3＝1～25％叶面积受侵染，5＝26～50％叶面积受侵染，7＝51-75％叶面积受侵染，9＝76-100％叶面积受感染)评分。抗白粉病鉴定结果显示，RUM5以及CN60/RUM5杂交获得的F1种子全抗，表明RUM5抗白粉病特性由显性基因控制。190个CN60/RUM5F2:3家系对白粉病的抗性级别频率分布呈连续分布。已有研究表明，绿豆白粉病抗性位点qPMRUM5-3位于连锁群9上，SSR标记CEDG070和CEDG259之间(Chankaew等2013)。我们根据绿豆参考序列对这两个标记的引物序列进行了BLAST搜索(http://plantgenomics.snu.ac.kr/sequenceserver)。该序列在第9染色体9,097,007bp到19,388,902bp之间，大小为10.292Mb，下载了该标记间序列，设计了55对SSR引物(表1)，在CN60和RUM5之间筛选多态性，以绿豆基因组DNA为模板，进行PCR反应。10μlPCR反应体系包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绿豆抗白粉病基因VrMOL12，其特征在于，选自以下任意一项：/n1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的基因，/n2)具有SEQ ID NO.2所示CDS序列的基因；/n3)与1)、2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种绿豆抗白粉病基因VrMOL12，其特征在于，选自以下任意一项：
1)具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的基因，
2)具有SEQIDNO.2所示CDS序列的基因；
3)与1)、2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。


2.含有权利要求1所述的绿豆抗白粉病基因VrMOL12的重组表达载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛晨晨，塞班，陈新，袁星星，陈景斌，普拉给特宋塔，披拉沙斯乃文，闫强，吴然然，张红梅，陈华涛，崔晓艳，刘晓庆，顾和平，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32