花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用。本发明专利技术通过设计sgRNA T1‑T4以构建CRISPR/Cas9基因组编辑系统，由sgRNA引导的Cas9酶在基因靶点对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B进行切割，经DNA修复后产生基因序列的插入或碱基的突变，从而完成对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的靶向突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。

【技术实现步骤摘要】
花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种花生突变体的制备方法、一种花生突变基因及其编码的蛋白质和应用，以及一种用于检测花生突变基因的引物。
技术介绍
花生作为优质食用油的原料，是我国重要的油料作物和经济作物，其总产量和消费量占世界的40％以上，出口量占世界的55％以上(联合国数据中心，2012)，在国际上具有很强的竞争力。花生种子含油量非常丰富，平均含油量可达51％左右，广受市场欢迎。花生油的主要成分有单不饱和脂肪酸油酸(C18:1，Δ9)、多不饱和脂肪酸亚油酸(C18:2，Δ9，Δ12)以及饱和脂肪酸棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)组成，其中，不饱和脂肪酸约为80％(油酸36％-67％，亚油酸15％-43％)，饱和脂肪酸占20％(棕榈酸6％-11％，硬脂酸2％-6％，花生酸5％-7％，山嵛酸2％-3％)。花生种子中的脂肪酸组成及其含量是衡量其品质优劣的重要指标。油脂稳定性方面，亚油酸属多不饱和脂肪酸，其油酰残基易氧化而导致油脂腐败劣变，严重影响油脂储存期；而油酸分子只含有一个双价不饱和键，化学结构相对比较稳定，抗氧化能力强，油酸的自氧化性比亚油酸稳定10倍，油酸/亚油酸比例高的花生更耐储存，在精炼、储藏和煎炸时不易变质，与普通花生相比，高油酸含量的花生具有更长的货架期。营养价值方面，花生油的品质对花生油固定消费人群的健康具有重要影响。油酸的营养价值较高，其可降低血液中低密度脂蛋白的含量，同时维持有益高密度脂蛋白水平，更有效地保护心脑血管，还能逆转炎性细胞因子TNF-α对胰岛素产生的抑制作用。在食品健康越来越受重视的今天，高油酸比例的食用油是众多食品加工企业平衡饱和脂肪酸和非饱和脂肪酸使用的一个优佳选择。因此，提高油酸含量已经成为花生品质育种的一个重要目标。去饱和脂肪酸酶(Δ12FAD或FAD2)是催化油酸的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸的关键酶，它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。分子生物学研究越来越多的证据表明，AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因，决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。栽培种花生(Arachishypogaea)是具有基因组A和基因组B的异源四倍体物种(2n＝4x＝40)，AhFAD2由位于不同基因组上的2对非等位同源基因AhFAD2A和AhFAd2B共同编码，它们分别来源于花生野生种A和B基因组，该2个基因均不属于种子特异表达基因，在普通油酸含量花生品种中这2个基因或者其中之一能正常表达，而在高油酸品种中，AhFAD2A和AhFAd2B基因均突变共同导致高油酸性状的产生。美国科学家最早从花生资源中鉴定筛选出油酸含量79％(O/L为37)的高油酸花生自然突变体F435。通过对普通油酸花生与F435序列比对发现，在AhFAD2A的编码区从起始密码子起第448bp碱基发现存在单碱基替换(G＞A)，使编码的蛋白质第150位氨基酸由天冬氨酸(D)转变为天冬酰胺(N)，而D150残基在所有FAD2中是绝对保守的，是高油酸性状的关键位点，突变导致AhFAD2A酶活性降低；在AhFAD2B基因起始密码子起第441_442bp处存在单碱基插入(442insA)，造成密码突变，导致翻译的蛋白质序列提前终止，产生无活性的蛋白。之后，美国科学家利用化学诱变直接育成了高油酸花生品种C458和M2-225，它们在AhFAD2A自然突变(G448A)基础上，诱变又使AhFAD2B基因起始密码子后第665bp和997bp处分别插入微型反向重复转座元件MITE(205bp)，导致肽链提前终止，使蛋白功能丧失。以上AhFAD2B突变基因均属于无义突变(Nonsensemutation)，使产生的蛋白不完全而丧失原基因的功能，已成为花生高油酸育种的基因源。然而，符合高油酸低软脂酸要求的花生种质资源长期掌握在国外研究机构及农资企业手中，同时受到国际政治博弈、专利保护等因素的钳制限制了这些优质资源在国内的应用。系谱分析追溯我国已育成高油酸品种的高油酸基因来源，70％以上品种的高油酸基因供体来源于F435。高油酸基因源单一化，已造成育成的高油酸品种遗传基础相对狭窄、遗传多样性下降，产量与品质的矛盾及优质与抗病性的矛盾日益突出。目前，国内生产上大面积应用的花生品种油酸含量普遍较低(＜50％)，而棕榈酸含量较高(＞11％)，国内花生种质资源的油酸含量均未超过70％，最大含量仅67.2％。国际上除上述F435高油酸基因资源外，最近，美国科学家又鉴定出2个新的高油酸花生自然突变体PI342664和PI342666，其AhFAD2A基因编码区448位G＞A突变与先前报道相同，而AhFAD2B基因突变C301G导致氨基酸H101D改变属于新的突变位点，最终使突变体油酸含量达到79％以上。印度花生育种家采用γ射线诱变抗病品种，获得2个新的高油酸突变体(GM6-1和GM4-3)，油酸含量均在75％以上，研究发现AhFAD2B基因发生碱基替换G1111A导致氨基酸G372S改变，从而产生高油酸表型。另外，国内花生研究者利用EMS化学诱变获得AhFAD2B基因新的突变位点C313T，引起氨基酸序列H105Y突变，使油酸含量由44％提高到60％以上。但是，传统的育种手段需要消耗大量的人力物力财力，在大量的自然群体或诱变群体中寻找极少的突变材料，不能在较短的时期内完成有针对性的育种任务，同时伴有极大的失败可能性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种花生突变体的制备方法、一种花生突变基因及其编码的蛋白质和应用，以及一种用于检测花生突变基因的引物，旨在解决现有对高油酸花生育种中存在工作量大的技术问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供了一种花生突变体的制备方法，其包括如下步骤：提供花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列、CRISPR/Cas9基因编辑载体和花生胚性愈伤组织；根据所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列，得到sgRNA靶点序列T1-T4；根据所述sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链，经混合退火，得到两端含所述粘性末端的双链DNAT1-T4；将所述双链DNAT1-T4分别与所述CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，得到基因编辑载体T1-T4；将所述基因编辑载体T1-T4中的至少一种对所述花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到所述花生突变体；其中，所述sgRNA靶点序列T1-T4的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-4所示，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列如SEQIDNO:5所示。本专利技术另一方面提供了一种花生突变基因，其是花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列发生突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶。该花生突变基因的核苷酸序列如SEQIDNO:8-16所示。本专利技术再一方面提供了上述花生突变基因编码的蛋白质，其氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种花生突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n提供花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列、CRISPR/Cas9基因编辑载体和花生胚性愈伤组织；/n根据所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列，得到sgRNA靶点序列T1-T4；/n根据所述sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链，经混合退火，得到两端含所述粘性末端的双链DNA T1-T4；/n将所述双链DNA T1-T4分别与所述CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，得到基因编辑载体T1-T4；/n将所述基因编辑载体T1-T4中的至少一种对所述花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到所述花生突变体；/n其中，所述sgRNA靶点序列T1-T4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列如SEQ ID NO:5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种花生突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列、CRISPR/Cas9基因编辑载体和花生胚性愈伤组织；
根据所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列，得到sgRNA靶点序列T1-T4；
根据所述sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链，经混合退火，得到两端含所述粘性末端的双链DNAT1-T4；
将所述双链DNAT1-T4分别与所述CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，得到基因编辑载体T1-T4；
将所述基因编辑载体T1-T4中的至少一种对所述花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到所述花生突变体；
其中，所述sgRNA靶点序列T1-T4的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-4所示，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列如SEQIDNO:5所示。


2.根据权利要求1所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2B的编码区序列是以花生去饱和脂肪酸酶基因FAD为模板，通过扩增引物进行PCR扩增得到，所述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，所述正向扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，所述反向扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。


3.根据权利要求2所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述扩增引物进行PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：于为常，张旺，
申请(专利权)人：深圳大学，深圳大学龙华生物产业创新研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44