一种纳米磁珠及其在2019新型冠状病毒核酸提取、扩增、检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种纳米磁珠及其在2019新型冠状病毒核酸提取、扩增、检测中的应用。该磁珠的制备方法包括以下步骤：在铁前驱体溶液中加入还原剂，18～28℃条件下搅拌后收集四氧化三铁颗粒；将四氧化三铁颗粒分散于聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的溶液中，形成混合液；盐析混合液后收集产物。温和的搅拌条件下合成的四氧化三铁颗粒利用盐析法，经聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的接枝使其上带有电荷，并结合氢键桥链得以能够吸附核酸。该磁珠在应用于核酸的提取过程中可无需进行洗脱步骤，而直接将吸附有核酸的磁珠扩增，不会影响后续扩增反应的进行，缩短了核酸提取的时间，减少了交叉污染可能性，降低了核酸在洗脱过程中的损失，简化了提取流程。

【技术实现步骤摘要】
一种纳米磁珠及其在2019新型冠状病毒核酸提取、扩增、检测中的应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种纳米磁珠及其在2019新型冠状病毒核酸提取、扩增、检测中的应用。
技术介绍
实时荧光RT-PCR检测病毒核酸时，不同提取试剂和手工提取流程的掌控对最后提取到的核酸数量和质量可能存在差别，而从标本中所提取出的核酸数量和质量对于检测方法中下一个步骤核酸扩增至关重要，从而也就直接影响最后的检测结果。因此病毒核酸的提取与纯化对RT-PCR检测结果的准确性起着决定性的作用。然而目前主流的病毒核酸提取过程操作复杂，提取时间较长。还有如酚提取/沉淀法，在提取过程中会用到氯仿、苯酚等有毒试剂，不利于实验人员健康。因此，近几年磁珠法核酸提取技术迎来了快速发展。其系列试剂不含氯仿/苯酚等有毒试剂，提取纯化的核酸质量好、产量高，并且易于实现自动化。这些优点及特点使得磁珠法核酸提取逐渐成为市面上主流的核酸提取方法。国内现有的磁珠法提取试剂，其磁珠的制备方法繁琐复杂，合成的磁珠在用于核酸提取时需要结合、孵育至少两次以上，才能用于下一步检测。磁珠往往因其影响后期反应的进行而不能跟随核酸样本进入扩增阶段，需要在此之前加入特定溶液洗脱使得目标核酸与磁珠脱离，并进一步清洗杂质，过程繁琐，程序复杂，并不能真正减少核酸提取过程的时间，且易造成交叉污染，影响后续扩增检测。因此，有必要提供一种能够使核酸由样本提取后无需洗脱即可扩增的磁珠。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种能够使核酸由样本提取后无需洗脱即可扩增的纳米磁珠及其在2019新型冠状病毒核酸提取、扩增、检测中的应用。第一方面，本专利技术的一个实施例提供了一种纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：在铁前驱体溶液中加入还原剂，18～28℃条件下搅拌后收集四氧化三铁颗粒；将四氧化三铁颗粒分散于聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的溶液中，形成混合液；盐析混合液后收集产物。本专利技术实施例的纳米磁珠的制备方法至少具有如下有益效果：专利技术人意外地发现，18～28℃搅拌的温和条件下合成的四氧化三铁颗粒利用盐析法，经聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的接枝使其上带有电荷，并结合氢键桥链得以能够吸附核酸。该磁珠在应用于核酸的提取过程中可无需进行洗脱步骤，而直接将吸附有核酸的磁珠扩增，不会影响后续扩增反应的进行，缩短了核酸提取的时间，不但减少了交叉污染可能性，而且降低了核酸在洗脱过程中的损失，极大地简化了整个提取流程。18～28℃及盐析条件制备的磁珠因其制备条件温和，表面包被分子具有良好生物相容性，使得磁珠能够与扩增体系兼容；同时，磁珠在合成后铁核被完全包被，不会有暴露的金属离子。因而不会对后续扩增检测荧光检测造成影响。同时，通过本方法制备得到的磁珠比表面积大、磁响应快、悬浮性好。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，铁前驱体为乙酰丙酮铁、氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的至少一种；还原剂为硼氢化钠。根据本专利技术的一些实施例的磁珠的制备方法，铁前驱体溶液的溶剂为水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、丙酮、异丙醇中的至少一种。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，铁前驱体溶液的溶剂为乙醇和水。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，乙醇和水的体积比为(0.5～2)：1。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，乙酰丙酮铁和硼氢化钠的质量比为(0.5～1)：(2～3)。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的质量比为(1.5～2.5)：(1～2)：(1～1.5)。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，盐析所用的盐溶液选自NaCl、Na2HPO3、NaH2PO3、KCl、K2HPO3、KH2PO3中的至少一种，盐溶液pH值为4～10，盐溶液的浓度为0.2～1.5mol/L。根据本专利技术的一些实施例的纳米磁珠的制备方法，盐析条件为-20℃～30℃，盐析时间为8h～24h。第二方面，本专利技术的一个实施例提供根据上述制备方法获得的纳米磁珠。第三方面，本专利技术的一个实施例提供上述纳米磁珠在核酸提取、扩增、检测中的应用。根据本专利技术的一些实施例，提供上述纳米磁珠在2019新型冠状病毒核酸提取、扩增、检测中的应用。第四方面，本专利技术的一个实施例提供一种核酸提取试剂，该核酸提取试剂包括上述的纳米磁珠。第五方面，本专利技术的一个实施例提供一种核酸提取方法，该核酸提取方法包括以下步骤：取上述的核酸提取试剂与待提取样本混合，得到核酸吸附物。采用该方法进行核酸的提取时，在得到核酸吸附物后，可以将其直接应用于后续的扩增步骤，同时也可以将磁珠洗脱后在进行扩增。本专利技术所提供的核酸提取试剂中的纳米磁珠在应用于核酸提取时可无需进行洗脱步骤，而直接将吸附有核酸的纳米磁珠扩增，缩短了核酸提取的时间，不但减少了交叉污染可能性，而且降低了核酸在洗脱过程中的损失，极大地简化了整个提取流程。当采用免洗脱的方法进行核酸的提取时，能够在半小时内提取相应的核酸样品，结合通用RT-PCR技术，灵敏度可达10个病毒颗粒载量，且线性范围横跨五个浓度梯度，性能优异。第六方面，本专利技术的一个实施例提供一种核酸提取试剂盒，该核酸提取试剂盒包括上述的核酸提取试剂。根据本专利技术的一些实施例的核酸提取试剂盒，还包括裂解液，裂解液包括十二烷基硫酸钠、尿素、氯化钠和碘化钠，裂解液的pH为4～8。十二烷基硫酸钠能够破坏磷脂酸分子层结构，利于核酸的释放，而氯化钠等可以改变样品的渗透压，使其更易裂解。裂解液中各组分的浓度可根据实际使用过程中的样品等条件的变化合理调整以提高裂解效率。根据本专利技术的一些实施例的核酸提取试剂盒，裂解液中各组分的浓度为0.1wt％～10wt％十二烷基硫酸钠、0.1wt％～10wt％尿素、0.01mol～1mol氯化钠和0.01mol-1～mol碘化钠。以该裂解液配合前述纳米磁珠采用免洗脱的方法进行核酸提取时，能够在半小时内完成对2019新型冠状病毒样品中核酸的提取，结合通用RT-PCR技术，灵敏度可达10个病毒颗粒载量，且线性范围横跨四个浓度梯度，性能优异。根据本专利技术的一些实施例的核酸提取试剂盒，还包括洗脱液，洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，洗脱液的pH为7～8。采用Tris进行洗脱可以保持核酸稳定性，避免其发生降解等情况从而降低扩增等操作的准确性。洗脱液中Tris的浓度在常规设置的基础上根据需求进行微调。根据本专利技术的一些实施例的核酸提取试剂盒，还包括乙醇洗液。采用乙醇溶液作为洗液能够在除杂的同时使核酸在溶液中呈不融解状态。附图说明图1是本专利技术的一实施例提供的纳米磁珠的电镜图。图2是本专利技术的一实施例提供的纳米磁珠的粒径分布图。图3是本专利技术的一实施例提供的纳米磁珠的磁响应结果图。图4是本专利技术的一实施例提供的纳米磁珠采用洗脱法提取2019新型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n在铁前驱体溶液中加入还原剂，18～28℃条件下搅拌后收集四氧化三铁颗粒；/n将所述四氧化三铁颗粒分散于聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的溶液中，形成混合液；/n盐析所述混合液后收集产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在铁前驱体溶液中加入还原剂，18～28℃条件下搅拌后收集四氧化三铁颗粒；
将所述四氧化三铁颗粒分散于聚乳酸、聚组氨酸和海藻酸钠的溶液中，形成混合液；
盐析所述混合液后收集产物。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述铁前驱体为乙酰丙酮铁、氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的至少一种；所述还原剂为硼氢化钠。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述铁前驱体为乙酰丙酮铁，所述乙酰丙酮铁和所述硼氢化钠的质量比为(0.5～1)：(2～3)。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸、所述聚组氨酸和所述海藻酸钠的质量比为(1.5～2.5)：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文华，赵振，宋文星，叶东，喻学锋，
申请(专利权)人：武汉中科先进技术研究院有限公司，中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42