一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法技术方案

本发明专利技术针对骨形态发生蛋白在存储使用过程中缺乏优质的载体材料这一问题，利用多巴胺自聚合的普适性将带正电荷的聚电解质、带负电荷的聚电解质、具有生物活性的陶瓷粉末通过层层组装的方式整合到钛基材上，构建了骨形态发生蛋白的缓释系统，实现了骨形态发生蛋白在病灶部位的长效缓释，且该缓释系统具有表面模量高、稳定、耐辐射、生物相容性好等优点，能够有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，预期能有效促进骨修复。

【技术实现步骤摘要】
一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法
本专利技术涉及蛋白缓释系统的制备，具体是涉及一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法。
技术介绍
骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)是促进体内成骨重要的因子，能跨种诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨，在颌面骨缺损修复、口腔种植、整形外科等领域被广泛应用。但目前，在应用过程中存在以下问题：1)BMP易在体液中快速扩散，也容易被蛋白酶所分解，治疗浓度难以维持，不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞，其诱导活性难以得到充分的发挥。2)周期性给予BMP通常需要侵入性的过程，如注射或输液，这些都是痛苦和麻烦的方法，而且大剂量和经常性给予BMP，也是不实际的，并且费用昂贵。3)BMP的作用不只是针对骨组织，它们也影响其他的细胞和器官。一个错误的给予会导致不该骨化的组织如临近肌肉、神经和血管的钙化。4)BMP的半衰期比较短，在所需部位直接和持续给与是必要的。5)对于较大的骨质缺损，BMP不能发挥支架作用，因此需要一种合适的载体材料与之协同作用。如果能够将BMP与合适的载体结合，一则BMP的消耗量会大幅度降低，二则可限定BMP在特定的缺损部位发挥作用，避免扩散，避免异位成骨，也更安全。因此，研究能持续释放BMP的缓释系统是十分必要的。目前用于制作缓释系统的材料主要包括天然载体、合成的生物可降解材料与其他无机物等。其中，天然载体如胶原、脱矿骨基质(demineralisedbonematrix，DBM)、壳聚糖等。这些材料的优势是具有良好的生物相容性和生物可吸收性，也可以改良。其缺点是因为是自然来源，取材加工过程中可能有疾病传播的可能，也有免疫原性，比起合成的聚合物结构复杂，专业生产复杂，多次加工会引起基质一致性上的差异，而且胶原与BMP的亲和性不佳，装载的BMP在植入体内两周就释放完毕；另外，这些聚合物缺乏机械强度，不能耐受压力。合成的生物可降解材料如聚乳酸(poly-lacticacid，PLA)、PGA及其共聚物(poly-lactide-co-glycolide，PLGA)等。这些材料来源丰富，可加工成各种形状，但它们的最大问题是对比同种异体骨移植，缺乏骨引导性，且具有疏水性，并且降解产物会使pH降低。因此，如何克服上述载体材料的缺点，构建一种更稳定、更安全和经济性较佳的骨形态发生蛋白缓释系统是临床上研究的主要挑战。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足，提供一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，主要采用层层组装的方法，将与BMP有良好亲和性的生物大分子多糖、多肽和羟基磷灰石有机结合于一体构建仿生多层膜，并将BMP装载于该多层膜之上，实现一种骨形态发生蛋白缓释系统的构建，具有长效、稳定、安全、经济的优点，且工艺条件温和、可适用的基材范围广。本专利技术采用的技术方案为，以钛材为基材，构建骨形态发生蛋白缓释系统：包括以下步骤：步骤一：活化钛材；将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在含有多巴胺的缓冲液中，反应12～72小时后，得到PDA修饰的Ti基材；步骤二：活化陶瓷粉末；将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于缓冲液中，震荡分散，在搅拌下反应12～72小时后，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液；步骤三：构建多层膜；将所述PDA修饰的Ti基材顺次在带正电的聚电解质溶液、带负电的聚电解质溶液、带正电的聚电解质溶液和所述PDA@HA溶液中各浸泡8～15min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为n次，得到(+/-/+/PDA@HA)n多层膜。进一步地优化制备方法，可以对所述(+/-/+/PDA@HA)n多层膜继续做强化处理。将所述(+/-/+/PDA@HA)n多层膜在交联溶液中浸泡6～24小时，随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后多层膜，记作x(+/-/+/PDA@HA)n多层膜。优选的，步骤一中所述含有多巴胺的缓冲液为多巴胺浓度为0.3～5.0mg/mL的Tris-HCl缓冲液，其pH为8～9。优选的，步骤二中所述陶瓷粉末为羟基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸钙、氧化铝或氧化锆中的任一种，所述陶瓷粉末和所述多巴胺的重量比为8～15:1。优选的，步骤三中所述带正电的聚电解质溶液是壳聚糖溶液或聚赖氨酸溶液中的任一种，浓度为0.3～5.0mg/mL；和/或，所述带负电的聚电解质溶液为葡聚糖溶液、肝素溶液、硫酸肝素溶液、海藻酸溶液、透明质酸溶液、胶原溶液、明胶溶液、卡拉胶溶液或醋酸纤维素溶液中的任一种，浓度为0.3～5.0mg/mL；和/或，步骤三中所述PDA@HA溶液为PDA@HA浓度为0.3～5.0mg/mL的溶液。优选的，所述循环次数n的取值大于3。优选的，所述交联溶液为浓度为25～70mg/mL碳化二亚胺溶液、5～25mg/mL硫代琥珀酰亚胺溶液、质量浓度为2.5％戊二醛溶液或质量浓度为1～4％的京尼平溶液中的至少一种。本专利技术还包括一种骨形态发生蛋白缓释系统，其特征在于：是根据上述任一种构建方法制备的骨形态发生蛋白缓释系统。本专利技术还包括一种装载有骨形态发生蛋白缓释系统的构建方法，其特征在于：将所述骨形态发生蛋白缓释系统浸泡到含有骨形态发生蛋白的溶液中进行装载；或，将含有骨形态发生蛋白的溶液直接滴加到所述骨形态发生蛋白缓释系统上。本专利技术还包括一种装载有骨形态发生蛋白缓释系统，其特征在于：根据上述的构建方法制备的装载有骨形态发生蛋白缓释系统。本专利技术的有益效果是：本专利技术针对骨形态发生蛋白在存储使用过程中缺乏优质的载体材料这一问题，利用多巴胺自聚合的普适性将带正电的聚电解质如壳聚糖(Chi)或聚赖氨酸，带负电的聚电解质如葡聚糖、肝素、硫酸肝素、海藻酸、透明质酸(Ha)、胶原、明胶、卡拉胶或醋酸纤维素，具有生物活性的陶瓷粉末如羟基磷灰石(HA)、生物活性玻璃、磷酸钙、氧化铝或氧化锆，通过层层组装的方式整合到钛基材上，构建了骨形态发生蛋白的缓释系统，实现了骨形态发生蛋白在病灶部位的长效缓释，且该缓释系统具有表面模量高、稳定、耐辐射、生物相容性好等优点，能够有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，预期能有效促进骨修复。以钛材作为基底材料时，主要是利用多巴胺在基底材料上类似于贻贝粘附蛋白的自聚合特性对钛材进行活化，经多巴胺活化后的钛材，可为后续对多层膜的铆定提供活性位点。随后引入多层膜，膜层组成主要是带正电的聚电解质、带负电的聚电解质和经PDA修饰的陶瓷颗粒，膜层的结构为(+/-/+/PDA@HA)n多层膜，其中，n代表四层膜的循环次数。对于膜层材料的具体种类，本专利技术又做了具体的限定，优选的如带正电的壳聚糖(Chi)，带负电的透明质酸(Ha)，和具有生物活性的羟基磷灰石(HA)，经n次循环得到的多层膜记作(Chi/Ha/Chi/PDA@HA)n多层膜，其中，羟基磷灰石(HA)能为体内新骨生成提供Ca2+离子源，促进骨及前骨细胞的黏附本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一：活化钛材；将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在含有多巴胺的缓冲液中，反应12～72小时后，得到PDA修饰的Ti基材；/n步骤二：活化陶瓷粉末；将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于缓冲液中，震荡分散，在搅拌下反应12～72小时后，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液；/n步骤三：构建多层膜；将所述PDA修饰的Ti基材顺次在带正电的聚电解质溶液、带负电的聚电解质溶液、带正电的聚电解质溶液和所述PDA@HA溶液中各浸泡8～15min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；/n步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为n次，得到(+/-/+/PDA@HA)

【技术特征摘要】
1.一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：活化钛材；将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在含有多巴胺的缓冲液中，反应12～72小时后，得到PDA修饰的Ti基材；
步骤二：活化陶瓷粉末；将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于缓冲液中，震荡分散，在搅拌下反应12～72小时后，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液；
步骤三：构建多层膜；将所述PDA修饰的Ti基材顺次在带正电的聚电解质溶液、带负电的聚电解质溶液、带正电的聚电解质溶液和所述PDA@HA溶液中各浸泡8～15min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；
步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为n次，得到(+/-/+/PDA@HA)n多层膜。


2.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：将所述(+/-/+/PDA@HA)n多层膜在交联溶液中浸泡6～24小时，随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后多层膜，记作x(+/-/+/PDA@HA)n多层膜。


3.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：步骤一中所述含有多巴胺的缓冲液为多巴胺浓度为0.3～5.0mg/mL的Tris-HCl缓冲液，其pH为8～9。


4.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：步骤二中所述陶瓷粉末为羟基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸钙、氧化铝或氧化锆中的任一种，所述陶瓷粉末与所述多巴胺的重量比为8～15:1。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈利燕，倪文飞，陈彦霖，金尘强，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33