一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，包括步骤：先将睾丸组织制成单根生精小管，然后将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，再使用冻存保护剂2对生精小管浸泡和灌注，实现玻璃化降温的同时最大程度地减少保护剂的渗透损伤，接着将灌注后的生精小管迅速转移至Cryo‑piece单精子冻存薄片上，套入Cryo‑tubule后直接浸入液氮中进行快速降温，降温后迅速置于复苏液中浸泡。相较于传统睾丸细胞悬液冻存方法本发明专利技术方法优点为：(1)保留了生精小管的完整结构；(2)有效减少睾丸细胞的氧化应激水平；(3)有效减少冻存后大量精原细胞和支持细胞的死亡；(4)生精小管内精子的回收率和活性高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法
本专利技术涉及丸组织冻存
，具体地说，是一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，即在生精小管内灌注冻存液后行玻璃化冷冻保存极少量的睾丸组织。
技术介绍
当前，全球范围内育龄人群生育力呈现整体下降趋势，WHO人类生殖特别规划署报告全球人群不孕不育率至少15％，全球不孕夫妇约6000-8000万对，不孕不育与肿瘤、心血管疾病并列成为当今影响人类健康的三大疾病。据人口协会公布的《中国不孕不育现状调研报告》，我国不孕不育率已高达15％-20％，不孕夫妇约为2000万对。其病因约60％是源自女方因素，而在男性方面，精子总数在50年间下降了一半以上(精子密度≥6000万/毫升降至≥1500万/毫升)，不仅如此，人类精子质量下降问题同样堪忧，无精症发生率约1％。大部分无精症属于睾丸生精功能损伤引起的非梗阻性无精子症，目前对于无精症的治疗手段主要有内分泌治疗和手术治疗等，其中内分泌治疗能够使约10％的无精症患者自发排精，这部分精子可以直接行卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)或通过稀少精子冷冻技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，其特征在于，包括步骤：/n(1)将睾丸组织制成单根生精小管；/n(2)将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，所述冻存保护剂1是由以下浓度的组分组成：10％DMSO、10％FBS和0.1M蔗糖；/n(3)接着将单根生精小管再置于冻存保护2中浸泡1min，同时将冻存保护2灌注到单根生精小管内，所述冻存保护剂2是由以下浓度的组分组成：20％DMSO、20％FBS和0.5M蔗糖；/n(4)将灌注、浸泡后的单根生精小管迅速转移至Cryo-piece单精子冻存薄片上，套入Cryo-tubule后直接浸入液氮中进行降温，降温后将单根生精小管先后分别置...

【技术特征摘要】
1.一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将睾丸组织制成单根生精小管；
(2)将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，所述冻存保护剂1是由以下浓度的组分组成：10％DMSO、10％FBS和0.1M蔗糖；
(3)接着将单根生精小管再置于冻存保护2中浸泡1min，同时将冻存保护2灌注到单根生精小管内，所述冻存保护剂2是由以下浓度的组分组成：20％DMSO、20％FBS和0.5M蔗糖；
(4)将灌注、浸泡后的单根生精小管迅速转移至Cryo-piece单精子冻存薄片上，套入Cryo-tubule后直接浸入液氮中进行降温，降温后将单根生精小管先后分别置于复苏液1中浸泡1min、复苏液2中浸泡3min，所述复苏液1是由以下浓度的组分组成：10％FBS和1M蔗糖，所述复苏液2是由以下浓度的组分组成：10％FBS、0.5M蔗糖和DF12；
(5)最后转移至常规培养条件下，即可。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体方法为：利用显微器械将睾丸组织去除间质黏连铺展成单根生精小管，然后将单根生精小管裁剪成长度≤1cm。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中是以1ul/s的速度将冻存保护2灌注到单根生精小管内，注射量为1～2ul/cm。...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮宇，韩厦，李铮，洪艳，李朋，田汝辉，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31