一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，包括步骤：先将睾丸组织制成单根生精小管，然后将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，再使用冻存保护剂2对生精小管浸泡和灌注，实现玻璃化降温的同时最大程度地减少保护剂的渗透损伤，接着将灌注后的生精小管迅速转移至Cryo‑piece单精子冻存薄片上，套入Cryo‑tubule后直接浸入液氮中进行快速降温，降温后迅速置于复苏液中浸泡。相较于传统睾丸细胞悬液冻存方法本发明专利技术方法优点为：(1)保留了生精小管的完整结构；(2)有效减少睾丸细胞的氧化应激水平；(3)有效减少冻存后大量精原细胞和支持细胞的死亡；(4)生精小管内精子的回收率和活性高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法
本专利技术涉及丸组织冻存
，具体地说，是一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，即在生精小管内灌注冻存液后行玻璃化冷冻保存极少量的睾丸组织。
技术介绍
当前，全球范围内育龄人群生育力呈现整体下降趋势，WHO人类生殖特别规划署报告全球人群不孕不育率至少15％，全球不孕夫妇约6000-8000万对，不孕不育与肿瘤、心血管疾病并列成为当今影响人类健康的三大疾病。据人口协会公布的《中国不孕不育现状调研报告》，我国不孕不育率已高达15％-20％，不孕夫妇约为2000万对。其病因约60％是源自女方因素，而在男性方面，精子总数在50年间下降了一半以上(精子密度≥6000万/毫升降至≥1500万/毫升)，不仅如此，人类精子质量下降问题同样堪忧，无精症发生率约1％。大部分无精症属于睾丸生精功能损伤引起的非梗阻性无精子症，目前对于无精症的治疗手段主要有内分泌治疗和手术治疗等，其中内分泌治疗能够使约10％的无精症患者自发排精，这部分精子可以直接行卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)或通过稀少精子冷冻技术保存。但是，大部分患者无法通过内分泌治疗自发排精，对于这类患者而言，显微镜下睾丸取精手术是其最后的治疗方案。一些生精功能没有完全丢失的患者的睾丸组织内残存具有完整精子发生的生精小管，这类生精小管在手术显微镜视野下比无精子的生精小管更加粗大和致密，被称之为“生精灶”，通常只存在于睾丸的极少部分区域。手术中将这些生精灶取出后，通过机械剥离和剪碎的方式释放出生精小管内的生精细胞，通过梯度密度离心等方法提纯精子后进行ICSI或冻存。上述手术的方式并没有解决患者生精障碍的根本病因。目前，精原干细胞体外培养扩增并诱导分化成有功能精子是重建NOA患者生育力最有前景的治疗方案。体内精子发生依赖于一个复杂的生精微环境，包括各类体细胞构成的生精小管结构和各类信号分析组成的调控网络。目前由于对体内精子发生微环境的了解不充分，使得体外培养体系的效率仍然较低，不足以用于临床治疗。同时，由于“生精灶”不可再生，NOA患者的生精障碍通常呈进行性进展，所以需要建立起一套保存手术取得的极少量睾丸生精小管组织的冷冻方法。目前对于男性睾丸组织/细胞的冻存方法主要有睾丸细胞悬液冻存和睾丸组织慢速降温冻存。前者将睾丸组织通过机械切割和酶消化的方法分离成细胞悬液，破坏了精子发生的空间结构，势必对体外培养产生影响。后者目前主要用于冻存非稀少量的睾丸组织，在冻存过程中容易产生较大型的尖锐的冰晶，同样破坏生精小管结构。近年来发展的组织器官的玻璃化冷冻技术可以减少冰晶的损伤，为了在降温过程中达到玻璃态，需要高浓度的冷冻保护剂和极快的降温速率。生精小管内具有一个相对封闭的管腔，通过直接浸入冷冻保护剂的方式很难使管腔内的液体达到所需浓度，此外，若延长冷冻保护剂的加载时间，则会增加冷冻保护剂对睾丸组织/细胞的渗透损伤。基于这些问题，我们开发了一项首先将冷冻保护剂灌注进生精小管，然后进行玻璃化降温的针对单根生精小管(稀少睾丸组织)的冻存方法，用于保存相关男性患者的生育能力，关于本专利技术的相关内容目前还未见有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于单根生精小管冻存液灌注后玻璃化降温的冷冻保存方法，用于保存完整的精子发生环境，保存相关男性患者的生育能力。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：首先，本专利技术提供了一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，包括步骤：(1)将睾丸组织制成单根生精小管；将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，所述冻存保护剂1是由以下浓度的组分组成：10％DMSO、10％FBS和0.1M蔗糖；接着将单根生精小管再置于冻存保护2中浸泡1min，同时将冻存保护2灌注到单根生精小管内，所述冻存保护剂2是由以下浓度的组分组成：20％DMSO、20％FBS和0.5M蔗糖；将灌注、浸泡后的单根生精小管迅速转移至Cryo-piece单精子冻存薄片上，套入Cryo-tubule后直接浸入液氮中进行降温，降温后将单根生精小管先后分别置于复苏液1中浸泡1min、复苏液2中浸泡3min，所述复苏液1是由以下浓度的组分组成：10％FBS和1M蔗糖，所述复苏液2是由以下浓度的组分组成：10％FBS、0.5M蔗糖和DF12；最后转移至常规培养条件下，即可。优选地，上述步骤(1)具体方法为：利用显微器械将睾丸组织去除间质黏连铺展成单根生精小管，然后将单根生精小管裁剪成长度为≤1cm。优选地，步骤(3)中是以1ul/s的速度将冻存保护2灌注到单根生精小管内，注射量为1～2ul/cm。优选地，步骤(4)中复苏液1和复苏液2使用前需要对其预处理加热至37℃。优选地，步骤(5)中常规培养条件包括：10％FBS的DF12培养基。优选地，所述的睾丸组织来源是生精功能没有完全丢失且残存有能完整发生精子的生精小管的患者。其次，本专利技术还提供了一种睾丸组织冻存试剂组合，所述的试剂组合包括：(1)冻存保护剂1：由10％DMSO、10％FBS和0.1M蔗糖组成；和(2)冻存保护剂2：由20％DMSO、20％FBS和0.5M蔗糖组成；和(3)复苏液1：由10％FBS和1M蔗糖组成；和(4)复苏液2：由10％FBS、0.5M蔗糖和DF12组成。进一步地，本专利技术还提供了如上所述的试剂在制备睾丸组织冻存的试剂盒中的应用。再者，本专利技术还提供了一种睾丸组织冻存的试剂盒，试剂盒内包括如上所述的试剂组合和该试剂盒的使用说明书，所述该试剂盒的使用说明书包括如上所述的方法。优选地，所述睾丸组织来源是生精功能没有完全丢失且残存有能完整发生精子的生精小管的患者。本专利技术优点在于：1、相较于传统睾丸细胞悬液冻存，本专利技术为将来可能的生精细胞培养保留了生精小管的完整结构。2、相较于传统睾丸组织团块慢速降温冻存，本专利技术将生精小管分散成单根，能显著减少睾丸组织间隙内大体积锋利冰晶的形成，能更好地避免生精小管的完整性被冰晶破坏(结果可见图3)。3、本专利技术通过单根神经小管内灌注冷冻保护剂，避免了睾丸组织在降温前长时间接触高渗溶液，降低了冷冻保护剂的渗透损伤和化学毒性损伤，有效地减少了睾丸细胞的氧化应激水平(结果可见图4)。4、本专利技术通过快速降温玻璃化冻存避免了细胞内冰晶的形成，能有效地减少冻存后大量精原干细胞和支持细胞的死亡(结果可见图5)。5、本专利技术的方法冻存的生精小管内精子的回收率和活性与目前临床常规使用的麦管玻璃化冷冻方法没有明显差异(结果可见图6)。综上，本方法优选各步骤、冻存保护剂种类及浓度和最佳冻存保护加载时间、最佳复苏液浓度及方法，可同时较好地保存生精小管结构、维持精子发生重要的体细胞、精原干细胞和成熟精子，为生精功能没有完全丢失的这类患者提供了新的治疗方案，能够实现保存相关男性患者的生育能力的目的。附图说明附图1是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，其特征在于，包括步骤：/n(1)将睾丸组织制成单根生精小管；/n(2)将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，所述冻存保护剂1是由以下浓度的组分组成：10％DMSO、10％FBS和0.1M蔗糖；/n(3)接着将单根生精小管再置于冻存保护2中浸泡1min，同时将冻存保护2灌注到单根生精小管内，所述冻存保护剂2是由以下浓度的组分组成：20％DMSO、20％FBS和0.5M蔗糖；/n(4)将灌注、浸泡后的单根生精小管迅速转移至Cryo-piece单精子冻存薄片上，套入Cryo-tubule后直接浸入液氮中进行降温，降温后将单根生精小管先后分别置于复苏液1中浸泡1min、复苏液2中浸泡3min，所述复苏液1是由以下浓度的组分组成：10％FBS和1M蔗糖，所述复苏液2是由以下浓度的组分组成：10％FBS、0.5M蔗糖和DF12；/n(5)最后转移至常规培养条件下，即可。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将睾丸组织制成单根生精小管；
(2)将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，所述冻存保护剂1是由以下浓度的组分组成：10％DMSO、10％FBS和0.1M蔗糖；
(3)接着将单根生精小管再置于冻存保护2中浸泡1min，同时将冻存保护2灌注到单根生精小管内，所述冻存保护剂2是由以下浓度的组分组成：20％DMSO、20％FBS和0.5M蔗糖；
(4)将灌注、浸泡后的单根生精小管迅速转移至Cryo-piece单精子冻存薄片上，套入Cryo-tubule后直接浸入液氮中进行降温，降温后将单根生精小管先后分别置于复苏液1中浸泡1min、复苏液2中浸泡3min，所述复苏液1是由以下浓度的组分组成：10％FBS和1M蔗糖，所述复苏液2是由以下浓度的组分组成：10％FBS、0.5M蔗糖和DF12；
(5)最后转移至常规培养条件下，即可。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体方法为：利用显微器械将睾丸组织去除间质黏连铺展成单根生精小管，然后将单根生精小管裁剪成长度≤1cm。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中是以1ul/s的速度将冻存保护2灌注到单根生精小管内，注射量为1～2ul/cm。...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮宇，韩厦，李铮，洪艳，李朋，田汝辉，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31