评估存在或不存在有复制能力的病毒的方法和试剂技术

提供了检测含有用编码重组和/或异源分子例如异源基因产物的病毒载体颗粒转导的细胞的样品中的有复制能力的病毒例如有复制能力的逆转录病毒如γ逆转录病毒或慢病毒的方法。所述方法可以包括评估在逆转录病毒中表达但在所述病毒载体颗粒中不表达的一种或多种靶基因如病毒基因的转录。如果所述一种或多种靶基因的RNA的水平高于参考值，则有复制能力的逆转录病毒可以被确定为存在，所述参考值可以直接或间接地测量，包括从含有来自已知水平和/或等于或高于测定的检测极限的相应靶基因的RNA的阳性对照样品测量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】评估存在或不存在有复制能力的病毒的方法和试剂相关申请的交叉引用本申请要求2018年1月31日提交的标题为“评估存在或不存在有复制能力的病毒的方法和试剂(MethodsandReagentsforAssessingthePresenceorAbsenceofReplicationCompetentVirus)”的美国临时专利申请号62/624,801的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。通过引用并入序列表本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。所述序列表作为2019年1月31日创建的标题为735042016040SeqList.txt的文件提供，其大小为46千字节。将电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
本公开文本涉及检测或确认不存在有复制能力的逆转录病毒的方法。所述方法可以包括评估一种或多种靶基因(如病毒基因，例如结构或包装基因)的DNA或RNA水平，来自所述基因的基因产物在某些被有复制能力的逆转录病毒(如γ逆转录病毒或慢病毒)感染的细胞中表达，但是在用于用异源核酸转导细胞的病毒载体中不存在，并且在不含有复制能力的逆转录本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测病毒DNA的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：/n(a)如果存在于生物样品中，在足以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增一种或多种病毒DNA的条件下孵育包含以下的混合物：(i)来自含有通过用包含异源核酸的慢病毒载体转导至少一种细胞而引入的所述异源核酸的所述至少一种细胞的DNA、(ii)对病毒DNA的一个或多个序列具特异性的至少一种正向寡核苷酸引物和至少一种反向寡核苷酸引物、(iii)对所述一种或多种病毒DNA中的每一种具特异性的寡核苷酸探针、和(iv)DNA聚合酶；以及/n(b)检测所述经扩增的核酸的存在、不存在、量或浓度，/n其中病毒DNA的所述一个或多个序列包括选自env、...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180131 US 62/624,8011.一种用于检测病毒DNA的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：
(a)如果存在于生物样品中，在足以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增一种或多种病毒DNA的条件下孵育包含以下的混合物：(i)来自含有通过用包含异源核酸的慢病毒载体转导至少一种细胞而引入的所述异源核酸的所述至少一种细胞的DNA、(ii)对病毒DNA的一个或多个序列具特异性的至少一种正向寡核苷酸引物和至少一种反向寡核苷酸引物、(iii)对所述一种或多种病毒DNA中的每一种具特异性的寡核苷酸探针、和(iv)DNA聚合酶；以及
(b)检测所述经扩增的核酸的存在、不存在、量或浓度，
其中病毒DNA的所述一个或多个序列包括选自env、gag、pol和rev基因的至少一部分的病毒DNA，并且所述至少一种正向和反向寡核苷酸引物包含：
(i)对所述VSV-Genv基因具特异性的正向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:35、50、51或54所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；和对所述env基因具特异性的反向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:36、52、53或55所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；
(ii)对所述pol基因具特异性的正向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:42、45或46所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；和对所述pol基因具特异性的反向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:43或47所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；
(iii)对所述gag基因具特异性的正向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:16、19或22所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；和对所述gag基因具特异性的反向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:17、20或23所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；
(iv)对所述rev基因具特异性的正向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:38所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；和对所述rev基因具特异性的反向寡核苷酸引物，其包含与SEQIDNO:39所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR是定量PCR(qPCR)。


3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述经扩增的核酸具有50至500个碱基对的长度。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述经扩增的核酸具有100至500个碱基对的长度。


5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述经扩增的核酸具有200至500个碱基对的长度。


6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述经扩增的核酸具有300至500个碱基对的长度。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述经扩增的核酸具有大于或大于约200个碱基对的长度。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述病毒DNA包括VSV-Genv基因的至少一部分，并且
(i)对所述env基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:35所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述env基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:36所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；
(ii)对所述env基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:50所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述env基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:52所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；或者
(iii)对所述env基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物序列的至少90％同一性和/或至少15个连续核苷酸与SEQIDNO:51所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸，且对所述env基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:53所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述病毒DNA包括VSV-Genv基因的至少一部分，并且所述寡核苷酸探针包含与SEQIDNO:37或56所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包含SEQIDNO:37或56所示的序列。


11.一种用于检测VSV-Genv基因或其部分的方法，所述方法包括：
(a)在足以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述env基因的条件下孵育包含以下的混合物：
(i)来自至少一种细胞的DNA，所述至少一种细胞含有通过用包含异源核酸的慢病毒载体转导所述至少一种细胞而引入的异源核酸；
(ii)对所述VSV-genv基因具特异性的正向寡核苷酸引物和对所述VSV-genv基因具特异性的反向寡核苷酸引物，其中所述正向和反向寡核苷酸引物分别选自SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示的序列；分别选自SEQIDNO:50和SEQIDNO:52所示的序列；或分别选自SEQIDNO:51和SEQIDNO:53所示的序列；
(iii)对所述VSV-genv基因具特异性的寡核苷酸探针，其包含SEQIDNO:37所示的序列；和
(iv)DNA聚合酶；以及
(b)检测所述经扩增的核酸的存在、不存在、量或浓度。


12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述正向寡核苷酸引物如SEQIDNO:35所示，并且所述反向寡核苷酸引物如SEQIDNO:36所示。


13.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述正向寡核苷酸引物如SEQIDNO:50所示，并且所述反向寡核苷酸引物如SEQIDNO:52所示。


14.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述正向寡核苷酸引物如SEQIDNO:51所示，并且所述反向寡核苷酸引物如SEQIDNO:53所示。


15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述病毒DNA包括gag基因的至少一部分，并且
(i)对所述gag基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:16所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述gag基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:17所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；
(ii)对所述gag基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:19所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述gag基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:20所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；或者
(iii)对所述gag基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:22所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述gag基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:23所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列。


16.根据权利要求1-10和15中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包含与SEQIDNO:21或24所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列。


17.根据权利要求1-10、15和16中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包含SEQIDNO:21或24所示的序列。


18.一种用于检测gag基因或其部分的方法，所述方法包括：
(a)在足以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述gag基因的条件下孵育包含以下的混合物：
(i)来自至少一种细胞的DNA，所述至少一种细胞含有通过用包含异源核酸的慢病毒载体转导所述至少一种细胞而引入的异源核酸；
(ii)对所述gag基因具特异性的正向寡核苷酸引物和对所述gag基因具特异性的反向寡核苷酸引物，其中所述正向和反向寡核苷酸引物分别选自SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示的序列；分别选自SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示的序列；或分别选自SEQIDNO:22和SEQIDNO:23所示的序列；
(iii)对所述gag基因具特异性的寡核苷酸探针，其包含SEQIDNO:21或24所示的序列；和
(iv)DNA聚合酶；以及
(b)检测所述经扩增的核酸的存在、不存在、量或浓度。


19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述正向寡核苷酸引物如SEQIDNO:16所示，并且所述反向寡核苷酸引物如SEQIDNO:17所示。


20.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述正向寡核苷酸引物如SEQIDNO:19所示，并且所述反向寡核苷酸引物如SEQIDNO:20所示。


21.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述正向寡核苷酸引物如SEQIDNO:22所示，并且所述反向寡核苷酸引物如SEQIDNO:23所示。


22.根据权利要求1-10和15-17中任一项所述的方法，其中所述病毒DNA包括pol基因的至少一部分，并且
(i)对所述pol基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:42所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述pol基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:43所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；
(ii)对所述pol基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:46所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述pol基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:43所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列；或者
(iii)对所述pol基因具特异性的所述正向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:46所示的序列具有至少90％同一性和/或具有所述序列的至少15个连续核苷酸的序列，且对所述pol基因具特异性的所述反向寡核苷酸引物包含与SEQIDNO:47所示的序列具有至少90％...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·贝瑞，E·韦伯，
申请(专利权)人：朱诺治疗学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US