一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，包括以下步骤，S1：病毒核酸的提取，S2:目的基因的克隆，S3：RPA引物和探针的设计，S4：RPA方法的建立，S5：特异性试验与灵敏度试验,S6：临床样品的检测。本发明专利技术利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37‑42℃下反应20‑30分钟即可，与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法
本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法。
技术介绍
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectiouslaryngotracheitisvirus,ILTV)能引起鸡的一种呼吸道的传染病，具有高度接触性和急性感染的特征，该病被称为鸡传染性喉气管炎。急性感染的鸡群可出现高的发病率和死亡率，慢性感染可引起结膜炎、产蛋和蛋品质下降，从1925年首次报道本病以来，已在全球各地流行，近些年来，在我国多地也呈流行趋势，给养鸡业造成的损失不容忽视。一个快速方便的检测方法对该疾病的控制是非常重要的。传统的检测ILTV的方法有病毒分离和血清学鉴定方法，但这些方法都费时费力。随着分子生物学的快速发展，一些依据核酸扩增的分子学方法也在实验室建立了，例如，普通PCR，荧光定量PCR，环介导等温扩增方法(LAMP)，液相基因芯片，GeXP多重PCR等，PCR跟荧光量PCR由于他们的特异性和灵敏度，用于实验室常规的检测方法，液相基因芯片和GeXP多重PCR由于他们的高通量，用于临床样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：病毒核酸的提取，使用DNA提取试剂盒对ILTV进行DNA提取，将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL载体RNA溶液，摇动混合物并混合，在56℃水浴15分钟后，加入250μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟，将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得病毒DNA；/nS2:目的基因的克隆，使用PCR方法扩增目的基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35个循环，72℃延伸1...

【技术特征摘要】
1.一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：病毒核酸的提取，使用DNA提取试剂盒对ILTV进行DNA提取，将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL载体RNA溶液，摇动混合物并混合，在56℃水浴15分钟后，加入250μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟，将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得病毒DNA；
S2:目的基因的克隆，使用PCR方法扩增目的基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec35个循环，72℃延伸10分钟，通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物；
将4.5μL回收产物与0.5μLpMD-18Tvector、5μLsolutionI总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜克隆到pMD-18T载体中，构建质粒；
将10μL连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中，将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min，金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min，加入1mLLB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养；
S3：RPA引物和探针的设计，从NCBI下载I...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛锋，蔡蔚游，李根，曾伟伟，朱余军，
申请(专利权)人：广东省实验动物监测所，
类型：发明
国别省市：广东;44