一种构建高效杀虫真菌的方法技术

本发明专利技术属于微生物学技术领域，提供了一种构建高效杀虫真菌的方法，该方法包括以下步骤：对杀虫细菌进行GFP标记，并筛选出具有较高表达的菌株；将标记过的杀虫细菌导入真菌原生质体内，进行共培养，筛选出转化成功的真菌；提取转化后的真菌DNA，利用杀虫细菌的特异性引物进行PCR扩增所提DNA，采用凝胶电泳验证转化成功的菌株。该方法成功将杀虫细菌导入到杀虫真菌体内，巧妙借助杀虫真菌的侵入系统将杀虫细菌直接送入昆虫血淋巴，改变了杀虫细菌进入昆虫的途径，融合了各自优势，加快了杀虫速度，克服了生物杀虫菌剂杀虫速度慢的瓶颈缺陷，将极大改变生物杀虫菌剂的未来。

【技术实现步骤摘要】
一种构建高效杀虫真菌的方法
本专利技术属于微生物学
，特别涉及一种构建高效杀虫真菌的方法，具体为一种将杀虫细菌导入杀虫真菌的方法。
技术介绍
近年来，由于化学杀虫剂的长期施用，对生物和环境都产生了严重危害，使农田生态系统的平衡遭受破坏，并导致害虫的抗药性增强。而各类微生物杀虫剂特异性强，极少杀伤害虫天敌和有益生物，对生态环境十分安全，并由多种因素和成分发挥作用，害虫难以产生抗药性，现已成为植物保护发展的重要方向。杀虫真菌能直接穿透害虫体壁进入虫体繁殖，消耗虫体营养，使代谢失调或在虫体内产生毒素杀死害虫，因而具有其它昆虫病原无可比拟的独特优越性；同时具有易培养、杀虫谱广、对温血动物无害等特点，如野村菌、绿僵菌等。然而，真菌也具有杀虫效果慢(需要6天以上)、不稳定(贮藏期间活性会下降)、价格偏高等明显弱点，严重妨碍了杀虫真菌在生产实践中的应用和发展。作为另一种重要的微生物杀虫剂，杀虫细菌是一类利用某些对昆虫有致病或致死作用的细菌。同杀虫真菌一样，细菌杀虫剂也具有一定的特异性和选择性，对人、畜及非目标昆虫安全等优点。但杀虫细菌也本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建高效杀虫真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、对杀虫细菌进行GFP标记，且所用质粒带有抗生素素抗性，并筛选出具有较高表达的菌株；/nS2、将标记过的杀虫细菌导入真菌原生质体内，然后进行共培养，利用荧光显微镜筛选出转化成功的真菌；/nS3、将转化成功的真菌转接到加入抗生素的SNY培养基中培养，采用CTAB法提取转化后的真菌DNA，利用杀虫细菌的特异性引物进行PCR扩增所提DNA，采用凝胶电泳验证转化成功的菌株；/nS4、将转化成功的菌株进行杀虫活力测定；/n其中，所述特异性引物在杀虫细菌的DNA中只能扩增出一条带，且在杀虫真菌的DNA中无法扩增出任何条带；所述杀虫细菌包括所...

【技术特征摘要】
1.一种构建高效杀虫真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对杀虫细菌进行GFP标记，且所用质粒带有抗生素素抗性，并筛选出具有较高表达的菌株；
S2、将标记过的杀虫细菌导入真菌原生质体内，然后进行共培养，利用荧光显微镜筛选出转化成功的真菌；
S3、将转化成功的真菌转接到加入抗生素的SNY培养基中培养，采用CTAB法提取转化后的真菌DNA，利用杀虫细菌的特异性引物进行PCR扩增所提DNA，采用凝胶电泳验证转化成功的菌株；
S4、将转化成功的菌株进行杀虫活力测定；
其中，所述特异性引物在杀虫细菌的DNA中只能扩增出一条带，且在杀虫真菌的DNA中无法扩增出任何条带；所述杀虫细菌包括所有具有杀虫活性的细菌，所述杀虫真菌包括所有具有杀虫活性的真菌。


2.根据权利要求1所述构建高效杀虫真菌的方法，其特征在于，步骤S2中，所述杀虫细菌导入真菌原生质体的具体方法如下：
a)杀虫真菌用SNY培养基培养并制备原生质体；
b)将GFP标记的杀虫细菌用LB培养基培养后，离心收集菌体备用；
c)将上述步骤得到的杀虫真菌原生质体和杀虫细菌分别用电击保护液清洗并调整浓度，使原生质体与杀虫细菌个数比约为1:50～200混合均匀，冰浴后进行电击处理；
d)将电击处理后的混合液冰浴20～30min，然后采用热激法处理3～4次；
e)取处理后的混合液转接到加入抗生素的STC培养液中，并在该培养液中加入PEG4000、二甲基亚砜和牛肉膏，18～28℃黑暗条件下复苏培养至出现菌丝悬浊液；
f)取(e)中培养液稀释涂布于带抗生素的SNY平板上，22～28℃黑暗培养，待出现菌丝后再倒入水琼脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：周燚，成胜，江健伟，孙正祥，方守国，龚天芝，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42