生物杀虫剂制造技术

本发明专利技术涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株，所述菌株在表型上是稳定的并且与野生型菌株相比具有增加的毒力，其中，所述增加的毒力通过在一次或多次传代期间将菌株暴露于诱变剂中而获得。这样的菌株特别适合用作生物杀虫剂。还描述了增加微生物杀虫剂中毒力的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物杀虫剂
本专利技术涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株及其用途，特别是其作为杀虫剂的用途。本专利技术还涉及包含苏云金芽孢杆菌菌株的组合物。此外，本专利技术涉及使用在宿主害虫种群中进行选择来使微生物杀虫剂传代以增加微生物杀虫剂的毒性的方法。
技术介绍
现有的害虫防治技术具有局限性。微生物杀虫剂和遗传修饰(GM)作物的功效与它们的化学或合成对应物一样不断受到抗性演化的威胁。在选择之前，一些重要的害虫对现有的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的易感性相对较低，而响应于微生物Bt杀虫剂的使用，鳞翅目的数个物种，尤其是小菜蛾(Plutellaxylostella)已经产生了抗性。在某些情况下与田间防治失败有关的对GM作物的抗性增加也开始出现(1，2)。应对抗性的一种策略是依靠发现新毒素。已经分离并表征了具有非常多样化的Cry毒素的大量Bt菌株。然而，尽管已知有许多毒素，但是很少有可以与一种特定类别(Cry1群组)的效力和广泛宿主相配的良好毒素。大多数的田间抗性响应于这些毒素而形成；Cry1毒素是对GM植物进行工程化的毒素的最常见类型(2)。如果这类的效力败给抗性，那么几乎没有类似的有效替代品。因此，可供选择的方法是尝试和修饰现有的充分表征的蛋白质以提高对抗性或耐受性害虫的毒性(3，4)。修饰当前利用的蛋白质的商业上重要的第二个益处是，与全新产品相比，其许可往往更容易且更便宜。为了响应这种对修饰毒素的偏爱，有几家公司已使用随机毒素诱变(“定向演化”)作为发现具有所需特性的毒素变体的手段。筛选突变体库的旧方法依赖于繁琐的生物测定和测序的组合。最近，一种成功方法对“噬菌体展示”方法进行了改进，开发对诱变的Cry蛋白的合成物体外筛选(5)。然而，这种体外方法确实具有产生对昆虫幼虫肠道蛋白酶敏感的Cry蛋白(5)的局限性。这也是受缚于单个蛋白质-蛋白质相互作用的过程，然而通常，基于蛋白质工程的方法只能应用于基于修饰蛋白质的转基因表达的生物防治方法。Bt原始且仍非常成功的应用是作为基于孢子和毒素的微生物产品。在生物体水平上改良生物防治产品的人工选择方法对于传统生物防治领域的菌株改良仍然可能是有价值的。微生物实验演化虽然仍是一个小领域，但对演化生物学产生了重大影响，并解决了基本的共演化、生态学和种群遗传学问题(6-9)。许多微生物，包括Bt，可以在实验室条件下迅速获得大量有益的突变(8，10，11)。实验演化为克服抗虫性提供了一种无机制的解决方案，并且可能适用于许多虫害和多种病原体。昆虫病毒的实验传代已成功用于增加生物防治剂的毒力以及用于鉴定具有改善的针对抗性宿主的作用的基因型(12)。病毒的高突变率使其成为通过选择进行改良的合适靶标。提高细菌病原体(例如Bt)适应抗性或耐受性宿主的速度的一种方法是提高其突变率。在不断发展的细菌种群中，高突变的菌株或“增变体”(13)(校对基因有缺陷)与大部分新的有益突变相关。突变率提高会赋予抗性宿主以增加的适应率的理论得到了广泛支持。例如，增变体通常通过强选择(14，15)和共演化军备竞赛(coevolutionaryarmsraces)(16)而受到青睐。与野生型菌株相比，增变体在模型昆虫宿主中演化出更高的毒力(17)。在艰难的选择下，即当生物的表型必须超过某个临界值以使其繁殖时，增变体可能更能赋予增强的适应性。在病原体中，这种类型的选择可能是普遍的，病原体可能必须表达某一阈值水平的毒力因子以便进入宿主(18，19)。在突变供应有限的小种群中，高突变率有望带来更多益处(18，19)。在每一轮侵染中，Bt都经历非常窄的种群瓶颈(20，21)，因此有效的种群大小可能是小的。增变体具有较高的重组率(22)，这可以促进大规模的遗传变化。虽然增变体可以获得有害突变，并预期会通过长期选择而被淘汰，但实验演化表明，它们可以在种群中持续数千代，而不会通过逆转或重组而被淘汰(19)。在理解微生物毒力方面，最近的一项重要进展是“社会演化”理论的应用，即与维持合作或利他性状有关的观念(7，24，25)。微生物以被称为公共物品生产的协同行为的形式参与。从经济角度讲，公共物品是使整个社区受益但对个人而言代价高昂的物品或服务。在细菌中，这种公共可用性是通过将代谢物长距离分泌到胞外空间而发生的。细菌公共物品包括生物膜、子实体的非孢子成分、毒力因子和对养分获取很重要的酶(25-28)。至关重要的是，这包括由Bt产生的Cry毒素，并且在一定程度上包括受群体感应调节的一系列营养产生因子(21，28)，这些因子对于使这些细菌能够入侵昆虫宿主至关重要。两个关键因素对于维持协同毒力很重要：高度相关性(或群组内的多样性低)和促进群组之间的竞争的种群结构(7)。关联性至关重要，因为通过多样化侵染，基因型之间的竞争将有利于“欺骗者(cheater)”突变体，这些突变体为有利于快速生长已经使昂贵的毒力产生无效。种群结构是将种群划分为一致的群组，这有助于对有利于群组而非个体的性状进行群组水平的选择。本专利技术的目的是克服与当前害虫防治有关的一个或多个问题。另一个目的是提供一种改进的害虫防治。优选地，害虫防治将利用诸如苏云金芽孢杆菌的微生物，并且菌株将具有更高的毒力特征。希望开发出能够使苏云金芽孢杆菌演化出多样化菌株并能够从多样化的池中选择最有效/毒力最强的菌株并改善毒力的方法。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供了一种苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株在表型上是稳定的并且与野生型菌株相比具有增加的毒力，其中，通过在一次或多次传代中将菌株暴露于诱变剂中实现增加的毒力。根据本专利技术的另一方面，提供了一种苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株包括苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillusthuringiensiskurstaki)NCTC17080301或苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种NCTC17080302或其突变体或衍生菌株。优选地，苏云金芽孢杆菌菌株相对于其祖先具有增加的毒力。苏云金芽孢杆菌菌株毒力的增加可以是其祖先毒力的至少10倍。更优选地，苏云金芽孢杆菌菌株毒力的增加可以是其祖先的毒力的至少100倍。诱变剂可包括甲磺酸乙酯(EMS)。苏云金芽孢杆菌菌株可以用作杀虫剂。优选地，苏云金芽孢杆菌菌株相对于其祖先对害虫具有增加的毒力。已经发现本专利技术的菌株有利地具有增强的针对目标害虫的杀灭能力，所述害虫包括具有至少一定程度的杀虫剂抗性的那些害虫。苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治害虫，所述害虫包括昆虫、螨虫、线虫和腹足。苏云金芽孢杆菌菌株可用于防治以下中的一种或多种：鳞翅目、双翅目、鞘翅目和线虫。苏云金芽孢杆菌优选可用于防治以下中的一种或多种：蚜虫、其他半翅目害虫、蓟马、鳞翅目幼虫、双翅目幼虫、鞘翅目幼虫、叶螨、蝗虫、蟋蟀、蚂蚁、蟑螂、苍蝇、黄蜂、白蚁木虫、木蚁、蛀书虫、蠹虫、皮蠹、衣蛾吉普赛蛾、恙螨、疥螨(Sarcoptesscabiei)、扁虱、螨虫、虱子、跳蚤、臭虫、蚊子、采采蝇、猎蝽、根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯胞囊线虫、蛞蝓和蜗牛。苏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苏云金芽孢杆菌菌株，所述苏云金芽孢杆菌菌株在表型上是稳定的并且与野生型菌株相比具有增加的毒力，其中，所述增加的毒力通过在一次或多次传代期间将菌株暴露于诱变剂而获得。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170811 GB 1712908.11.一种苏云金芽孢杆菌菌株，所述苏云金芽孢杆菌菌株在表型上是稳定的并且与野生型菌株相比具有增加的毒力，其中，所述增加的毒力通过在一次或多次传代期间将菌株暴露于诱变剂而获得。


2.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述诱变剂包括甲磺酸乙酯(EMS)。


3.根据权利要求1或2所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株用作杀虫剂。


4.根据权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述杀虫剂用于防治以下中的一种或多种：蚜虫、其他半翅目害虫、蓟马、鳞翅目幼虫、双翅目幼虫、鞘翅目幼虫、叶螨、蝗虫、蟋蟀、蚂蚁、蟑螂、苍蝇、黄蜂、白蚁木虫、木蚁、蛀书虫、蠹虫、皮蠹、衣蛾吉普赛蛾、恙螨、疥螨、扁虱、螨虫、虱子、跳蚤、臭虫、蚊子、采采蝇、猎蝽、根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯胞囊线虫、蛞蝓和蜗牛。


5.根据权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述杀虫剂用于防治小菜蛾Plutellaxylostella及其幼虫。


6.根据权利要求3至5中任一项所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述杀虫剂被施用至十字花科植物的土壤、土壤附近或土壤中。


7.前述权利要求中任一项所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌菌株包括苏云金芽孢杆菌肠杆菌杀虫亚种、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种或苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种。


8.一种组合物，所述组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的苏云金芽孢杆菌菌株。


9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌菌株为孢子或晶体形式。


10.根据权利要求8或9所述的组合物，其特征在于，所述组合物为固体或液体形式。


11.根据权利要求8至10所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含以下成分中的一种或多种：润湿剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂和表面活性剂以及分散介质，例如水或食用油。


12.根据权利要求8至11所述的组合物，其特征在于，所述组合物用作杀虫剂。


13.根据权利要求8至12所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于通过喷雾、铺开或喷洒而施用于植物、土壤表面和/或土壤本身中。


14.一种改善微生物杀虫剂的毒力的方法，所述方法包括：
(a)将害虫种群划分为亚群；
(b)使害虫亚群接触一种或多种微生物杀虫剂；
(c)从死亡率最高的亚群中选择害虫尸体；
(d)用害虫尸体接种孢子形成培养基，以便为随后的侵染提供足够的易于定量的接种物；
(e)从选择的尸体中纯化和定量微生物孢子，以鉴定一种或多种具有改善的毒力的微生物杀虫剂；并且
其中，所述微生物杀虫剂暴露于诱变剂。


15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括使用来自步骤(e)的微生物孢子侵染一个或多个第二害虫种群。


16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，步骤(a)至(e)至少重复一次，并且任选地，所述微生物杀虫剂重复暴露于所述诱变剂。


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【专利技术属性】
技术研发人员：本·雷蒙德，尼尔·克里克莫尔，
申请(专利权)人：埃克塞特大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB