乙型肝炎病毒（HBV）特异性B细胞表位检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞检测方法及其应用。本方法首次利用HBV病毒蛋白重叠多肽对HBV感染者血清抗体识别的HBV蛋白B细胞线性表位进行检测，克服了现有技术中无法检测HBV特异性B细胞表位的技术缺陷；本发明专利技术使用的单肽检测浓度仅需0.68μg/mL，成本低，操作简单，快速，检测结果相较与现有技术更加准确，尤其是对于常规方法无法检测的慢性HBV感染，本发明专利技术在能完全检测到的情况下，还能对表位做出准确的分析，具有极高的市场价值。

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒（HBV）特异性B细胞表位检测方法及其应用
本专利技术涉及细胞检测领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞表位检测方法及其应用。
技术介绍
HBV感染可导致严重肝病，包括急性和慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌。1990年至2015年之间，世界肝癌的发病率增加了75％，其中42％为HBV继发的相关肝细胞癌(HCC)。最新统计表明，病毒性肝炎已成为全球发病率和死亡率的第七大诱因，每年共计造成全球145万人死亡，其死亡率远超艾滋病毒、疟疾和结核病。在HBV感染过程中，适应性免疫应答决定了HBV感染的预后。既往研究多聚焦于HBV特异性T细胞免疫应答方面，对HBV特异性B细胞的作用机制研究较少。目前，现有技术中对于B细胞表位研究方法的方法主要有蛋白质化学技术、分子生物学技术、噬菌体表达肽库法、预测法、X射线晶体衍射以及NMR(核磁共振)技术等。蛋白质化学技术，主要通过化学试剂或酶处理抗原，将抗原分解成多种小片段，通过分析这些抗原小片段与抗体或者抗血清的作用判定抗原-抗体相互作用的位置。或采用水解抗原-抗体复合物法(即蛋白质足迹分析，proteinfootprinting)。但蛋白质化学技术也存在着很多缺陷，如析抗原表位过程复杂，分抗原抗体结合条件、酶解条件、酶解片段大小、解离后的片段能否有效分离等因素容易对分析结果产生影响。分子生物学技术的技术缺陷在于其要求对蛋白质抗原的氨基酸序列或者其基因序列较为清楚，需要不断合成表达新的蛋白来验证，工作量大。噬菌体表达肽库法需要利用基因工程技术进行多轮构建噬菌体，技术、设备要求高，工作量大、耗时长。而且，表达肽库技术筛选的抗原表位为模拟表位(minotope)，其有可能与实际抗原的氨基酸序列差距很大；其只有模拟表位与抗原氨基酸序列高度同源或者相似度很高，并且其三维构象或者在抗原分子三维结构中的位置一致时才可以称作抗原表位。此外，需要考虑的一点是，表达肽库法受肽库容量大小的限制；一般表达的肽段长度为6到8个氨基酸。现有技术中对于预测法分析蛋白抗原B细胞表位效率不高，预测准确度一般小于50％。X射线晶体衍射需要大量高纯度蛋白质形成的晶体；而现有技术中还无法对所有蛋白质进行分离纯化，其中部分蛋白质无法获得有效的结晶，抗原抗体复合物也被证明较难形成结晶。而且，X射线晶体衍射需要特殊仪器设备，成本较高。NMR(核磁共振)技术对样品的需要量大且不能分析分子量很大的复合物(大于40kD)。另外，需要特殊仪器设备，成本较高。因此，为了解决上述的技术缺陷，开发一种简单、可行的HBV特异性B细胞线性表位测定方法，对于HBV特异性T细胞免疫应答方面的研究，以及乙型肝炎病毒的防治与治疗，都具有极为重要的研究价值。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种HBV特异性B细胞表位的检测方法；本专利技术的另一目的在于提供上述检测方法在HBV特异性B细胞表位肽库筛选与构建中的应用；本专利技术的另一目的在于提供上述的检测方法在HBV诊断中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种HBV特异性B细胞表位的检测方法，该检测方法包括如下步骤：采集血清样品；用检测肽库包被液对容器包被，洗涤，加入封闭液封闭；去除封闭液，加入采集的血清样品，孵育；洗涤，加入山羊抗人IgG-biotin抗体，孵育；洗涤，加入显色剂，孵育，加入显示终止液，根据反应结果，定性HBV特异性B细胞表位；其中，所述检测肽库包括构成同一种HBV蛋白的单肽中的一种或多种。B细胞主要通过产生抗HBV抗体发挥作用，还可以通过提呈HBV抗原和分泌细胞因子调节其他免疫细胞的状态和功能来抗病毒。HBV感染人体后，可在人体产生不同的HBV病毒蛋白，包括表面抗原(S)、E抗原(E)、核心抗原(C)等，这些病毒蛋白抗原都可以诱导机体产生相应的抗体，不同抗体提示HBV感染者的不同疾病状态。血浆中表面(S)抗体阳性提示疾病缓解和病毒控制，而高滴度的核心蛋白(C)抗体往往提示肝损伤。表面蛋白preS1(前S1)区，尤其是aa2-48、loop区(又称α-deerminant)以及aa104-163，诱导的抗体具有中和作用。针对不同氨基酸片段(即表位)的抗体抗HBV感染的作用不一。抗体产生需要B细胞受体(BCR)对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇，又称表位。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。本专利技术通过对表达特定抗原的重叠序列的一组重组蛋白进行抗体结合分析，从而避免了现有技术的复杂性。本专利技术可以通过已知关联序列不断表达更小的蛋白将抗体识别的区域定位于较小的范围内，甚至到数十个氨基酸残基组成的多肽。本专利技术的特异性B细胞线性表位的检测体系并不是通用检测体系，由于不同实验对象对不同病原体的特异性差异，使同样的特异性B细胞线性表位的检测体系并不能在不同物种或不同病原体的检测中同样有效。进一步地，上述检测方法中设置有阴性对照；上述阴性对照的封闭液为HIVP29蛋白包被液10-20μg/mL。进一步地，通过上述显色反应后的光密度值判断上述样品的反应结果；若显色反应后的样品光密度值为阴性对照中的光密度值的两倍或以上，则样品中含有检测肽库中的HBV蛋白。进一步地，上述封闭液为山羊血清。当然，可以根据实际需求，合理的用本领域中其他可替代性的封闭液。专利技术人探究了不同封闭剂的封闭效果，包括小牛血清、胎牛血清、脱脂牛奶、山羊血清等，发现山羊血清封闭效果最佳；同时探索了不同公司的抗人IgG-biotin抗体，发现Bethyl公司，货号A80-104P的抗体效果最佳。进一步地，上述HBV蛋白包括S蛋白、C蛋白、P蛋白、X蛋白。进一步地，上述检测肽库中的单肽浓度范围为0.34-1.37μg/mL。本专利技术的第二个方面，提供：上述检测方法在HBV特异性B细胞表位肽库筛选与构建中的应用。专利技术人发现，本专利技术的检测方法同样具有识别特定肽段的特异性，因此，可以用来进行特定肽库的筛选与构建。本专利技术的第三个方面，提供：上述的检测方法在HBV诊断中的应用。其中该检测方法不用于疾病的诊断与治疗。进一步地，上述HBV包括不同状态的慢性HBV感染。更进一步地，上述慢性HBV感染的不同状态包括免疫耐受、免疫激活、免疫清除和乙肝表面抗原清除阶段。本专利技术的有益效果是：本方法首次利用HBV病毒蛋白重叠多肽对HBV感染者血清抗体识别的HBV蛋白B细胞线性表位进行检测，检测用的单肽浓度仅需0.68μg/mL，操作简单，快速，检测结果相较与现有技术更加准确，尤其是对于常规方法无法检测的慢性HBV感染，本专利技术在能完全检测到的情况下，还能对表位做出准确的分析，为HBV的后续治疗以及未来研究带来了新的方向与参考。附图说明图1为本专利技术的表位筛选实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBV特异性B细胞表位的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：/n采集血清样品；/n用检测肽库包被液对容器包被，洗涤，加入封闭液封闭；/n去除封闭液，加入采集的血清样品，孵育；/n洗涤，加入山羊抗人IgG-biotin抗体，孵育；/n洗涤，加入显色剂，孵育，加入显示终止液，根据反应结果，定性HBV特异性B细胞表位；/n其中，所述检测肽库包括构成同一种HBV蛋白的单肽中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种HBV特异性B细胞表位的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
采集血清样品；
用检测肽库包被液对容器包被，洗涤，加入封闭液封闭；
去除封闭液，加入采集的血清样品，孵育；
洗涤，加入山羊抗人IgG-biotin抗体，孵育；
洗涤，加入显色剂，孵育，加入显示终止液，根据反应结果，定性HBV特异性B细胞表位；
其中，所述检测肽库包括构成同一种HBV蛋白的单肽中的一种或多种。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中设置有阴性对照；所述阴性对照的封闭液为HIVP29蛋白包被液10-20μg/mL。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，通过所述显色反应后的光密度值判断所述样品的反应结果；
若显色反应后的样品光密度值为阴性对照中的光密度值的两倍或以上，则样品中含有检测肽库中的HBV蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李咏茵，唐利波，易璇，郭玲，王卫彬，古书琴，温春花，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44