靶向HCMV的TCR及其获得方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种靶向HCMV的TCR，属于细胞免疫治疗技术领域。所述TCR包括α链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，以及β链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，所述α链的CDR3可变域选自SEQ ID NO:1序列，所述β链的CDR3可变域选自SEQ ID NO:2序列。上述靶向HCMV的TCR，包括α链(CDR1，CDR2，CDR3)的以及β链(CDR1，CDR2，CDR3)，可将包括上述TCR的T细胞通过体外扩增并回输到病人体内，由于该T细胞能够特异性识别HCMV病毒抗原，从而重构病人对HCMV病毒的免疫功能，抑制病毒增殖并杀死被感染细胞。

【技术实现步骤摘要】
靶向HCMV的TCR及其获得方法和应用
本专利技术涉及细胞免疫治疗
，特别是涉及一种靶向HCMV的TCR及其获得方法和应用。
技术介绍
人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)属于疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)，全球80％以上人群血清检测呈现CMV阳性，且一旦被感染便会终生携带。HCMV在具有健全免疫力的健康人群中往往是无症状的，病毒的间接性复活(REF)能够被免疫系统检测并有效的控制。然而，对于免疫功能低下或者免疫功能被抑制的人群或者病人，譬如接受器官移植和造血干细胞移植的病人、艾滋病患者和正在发育中的胎儿，HCMV的感染或者复活通常会引起发病甚至造成死亡。造血干细胞移植和器官移植往往是血癌患者和某些疾病患者的终极治疗手段，而HCMV复活是引起干细胞/器官移植手术后病毒感染综合症的主要原因之一，无法控制的病毒复制往往会造成多器官衰竭以致威胁生命。目前通常的预防措施和一线治疗手段是使用抗病毒分子抑制剂，然而这些药物本身的毒性也会对病人造成伤害；同时相当一部分病人会产生耐药性，引起HCMV再次复活。尽管HCMV疫苗的研发从1900年起就一直在进行中，但目前并没有相关疫苗获批进入临床治疗。在被病毒感染的细胞中，病毒蛋白抗原短肽(peptide)能够结合主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex,MHC)形成p-MHC复合体，再被呈递到细胞膜表面。T细胞通过其细胞表面表达的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)，特异性的识别被感染细胞表面所呈递的抗原短肽。TCR和p-MHC的特异性结合将会激活T细胞，特异性识别、杀死表达病毒蛋白的被感染细胞，并可以在患者体内建立长期的免疫记忆。T细胞过继性免疫治疗是将T细胞(具备能够特异性识别致病病毒抗原的TCR)通过体外扩增并回输到病人体内，从而重构病人对这种病毒的免疫功能，抑制病毒增殖并杀死被感染细胞。TCR识别特定种类的HLA-抗原决定簇复合物并发挥功能，而人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)在人群中具备高度的多样性，造成TCR的普适性较低，常规的TCR则存在这样的问题：按照传统技术对人的外周血T细胞进行测序(成本较低)，可测得十万、百万级数量的α及β链序列，但是无法确定哪些是来自于同一个细胞，且无法确定正确配对的α-β对；而采用更先进的单细胞测序技术，可得到正确配对的α-β对，可经化学合成之后再进行功能筛选，但因α、β肽链长合成成本高、进行筛选数量多、耗时长，导致针对某一疾病靶点开发免疫治疗的难度非常大。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种靶向HCMV的TCR，可通过T细胞过继性免疫治疗，特异性识别、杀死病人体内的HCMV病毒，并建立长期的免疫记忆。一种靶向HCMV的TCR，所述TCR包括α链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，以及β链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，所述α链的CDR3可变域选自SEQIDNO:1序列，所述β链的CDR3可变域选自SEQIDNO:2序列。上述靶向HCMV的TCR，包括α链(CDR1，CDR2，CDR3)的以及β链(CDR1，CDR2，CDR3)，其中，α链的CDR3和β链的CDR3区选自特定的序列，通过上述序列的正确配对，可实现对HCMV的亲和靶向；从而可将包括上述TCR的T细胞通过体外扩增并回输到病人体内，由于该T细胞能够特异性识别HCMV病毒抗原，从而重构病人对HCMV病毒的免疫功能，抑制病毒增殖并杀死被感染细胞。在其中一个实施例中，所述α链可变域的CDR1、CDR2可变域分别选自SEQIDNO:3序列、SEQIDNO:4序列；所述β链可变域的CDR1、CDR2可变域分别选自SEQIDNO:5序列、SEQIDNO:6序列。上述正确配对的α链和β链，具有生物活性，能够起到特异性识别HCMV病毒，建立长期免疫记忆的功效。可以理解的，所述靶向HCMV的TCR，除上述可变域外，其余序列可通过查阅公开数据库如IMGT(http://www.imgt.org/)、VDJdb(https://vdjdb.cdr3.net/search)等来获得人的恒定区氨基酸序列，结合上述的CDR3β、CDR3α序列信息，即可得到整条TCR的氨基酸序列。在其中一个实施例中，所述TCR序列如SEQIDNO:8所示。在其中一个实施例中，所述TCRα链的CDR1、CDR2和CDR3可变域与SEQIDNO:3序列、SEQIDNO:4序列和SEQIDNO:1序列具有90％以上的相似性；所述TCRβ链的CDR1、CDR2和CDR3可变域与SEQIDNO:5序列、SEQIDNO:6序列和SEQIDNO:2序列具有90％以上的相似性。本专利技术还公开了上述的靶向HCMV的TCR的获得方法，包括以下步骤：1)从外周血中分离得到原代CD8+T细胞，与搭载CMV抗原多肽的抗原呈递细胞共孵育，靶向CMV的原代CD8+T细胞受刺激后增殖，达到富集效果；2)针对上述靶向CMV的CD8+T细胞，制备TCR表达文库和测序文库，经高通量测序得到TCR文库所有TCR序列信息以及TCR的富集情况；3)将TCR表达文库导入细菌体内涂板筛选得到阳性单克隆菌落，经测序，将序列与高通量测序结果进行比对，根据上述TCR的富集情况，挑选得到富集的TCR，获得其序列信息；4)在细胞水平验证上述获得TCR的功能，获得靶向HCMV的阳性TCR。上述方法中，通过将CD8+T细胞，与搭载CMV抗原多肽的抗原呈递细胞(DC细胞)共孵育，后者可刺激靶向CMV的CD8+T细胞的增殖，以达到富集效果，而出现富集情况(即数量增多)的TCR才有可能是阳性的TCR。可以理解的，针对靶向CMV的CD8+T细胞克隆得TCR文库的方法，按照常规方法即可，如可参考WO2020036875A1文献公开方法。在步骤3)中，因靶向CMV的TCR经富集之后，占TCR文库的大多数，随机挑选细菌单克隆即可容易获得靶向CMV的TCR(不止一个)，随后再将测序结果与高通量测序结果比对，属于被富集的序列，为目标阳性TCR。在其中一个实施例中，步骤1)中，所述CMV抗原多肽为SEQIDNO:7所示序列。在其中一个实施例中，步骤1)中，所述抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞的数量比为1:3-5。在其中一个实施例中，步骤3)中，将所述阳性TCR的核酸序列克隆至pJET1.2质粒，再将质粒文库导入工程菌内，经菌液涂板并培养，得到阳性单克隆菌落；经测序，与步骤2)中得到的TCR序列信息进行比对，得到阳性单克隆菌落的TCR序列信息。在其中一个实施例中，步骤4)中，在细胞水平验证上述获得TCR的功能；具体采用以下方法：通过CMV-TetramerPE染色，鉴定所述TCR是否正确识别并结合CMV-Tetramer，如可正确识别并结合CMV-Tetramer，即为靶向HCMV的阳性TC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向HCMV的TCR，其特征在于，所述TCR包括α链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，以及β链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，所述α链的CDR3可变域选自SEQ ID NO:1序列，所述β链的CDR3可变域选自SEQ ID NO:2序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向HCMV的TCR，其特征在于，所述TCR包括α链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，以及β链的CDR1、CDR2和CDR3可变域，所述α链的CDR3可变域选自SEQIDNO:1序列，所述β链的CDR3可变域选自SEQIDNO:2序列。


2.根据权利要求1所述的靶向HCMV的TCR，其特征在于，所述α链可变域的CDR1、CDR2可变域分别选自SEQIDNO:3序列、SEQIDNO:4序列；所述β链可变域的CDR1、CDR2可变域分别选自SEQIDNO:5序列、SEQIDNO:6序列。


3.根据权利要求2所述的靶向HCMV的TCR，其特征在于，所述TCR序列如SEQIDNO:8所示。


4.根据权利要求1或2所述的靶向HCMV的TCR，其特征在于，所述TCRα链的CDR1、CDR2和CDR3可变域与SEQIDNO:3序列、SEQIDNO:4序列和SEQIDNO:1序列具有90％以上的相似性；所述TCRβ链的CDR1、CDR2和CDR3可变域与SEQIDNO:5序列、SEQIDNO:6序列和SEQIDNO:2序列具有90％以上的相似性。


5.权利要求1-4任一项所述的靶向HCMV的TCR的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从外周血中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，赵悦，杨海燕，毛爽，
申请(专利权)人：广州呈源生物免疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44