一种特定微生物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特定微生物的检测方法，包括以下步骤：ａ．捕捉步骤，选择对应于特定微生物种类的抗体，通过抗体和特定种类微生物之间的特异性反应捕捉被测样本中的特定微生物；ｂ．分离步骤，分离捕捉到的特定微生物和被测样本；ｃ．酶释放步骤，向分离后特定微生物的溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，使得所述特定微生物中的过氧化氢酶释放，进入溶液中；ｄ．检测步骤，向上述溶液中添加过氧化氢，并等待；检测得到过氧化氢酶的浓度，进而得到所述特定微生物的浓度。本发明专利技术具有检测精度高、检测灵敏度高、可检测特定微生物等优点，可广泛应用在食品安全检测中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物的检测，特别涉及，如细菌 和真菌的检测。
技术介绍
食品安全目前已成为人们非常关注的一个问题。据统计，在各种食品安全 问题中，由于微生物污染，特别是有害、致病微生物污染所引起的占了很大的 比例。因此，需要专门的技术检测食品中的微生物。目前，食品中微生物检测的常规方法，大多数是以培养活的细胞生长为手 段来达到检测目的，如平板菌落计数法等。虽然这些方法检测灵敏度很高，但 这些方法均需要在实验室的无菌条件下进行，并且需要一定的培养时间，所以比较麻烦和费时，需要24小时或者更长的时间才能有结果。在食品安全检测中，人们总希望尽快得到检测结果。若是像平板菌落计数法一样，所得到的结果往往只能作为事后的辅助验证了。为了解决常规检测方法耗时长的不足，人们也开始研究各种快速的微生物检测方法，并得到了一定的结果，如ATP生物发光法，就是利用微生物细胞内存在的ATP即三磷酸腺苷，当荧光素酶系统和ATP接触时会发光，这样通过光强度的检测就可以推知样品中微生物的含量。法国梅里埃公司推出了一种微生物生长过程中由于新陈代谢而改变培养基 的成分，从而通过电阻抗的测量来达到微生物快速检测的Bactometer系统。与 此相类似的还有Malthus的Malthus Microbial Analyser系统。另外，随着免疫技术和分子生物学的发展，人们也开发出一些基于免疫反 应或PCR技术的微生物检测技术。但是，上述技术，特别是快速检测技术，还存在诸多不足，如31、 目前所研究开发的快速检测方法中，检测时间还较长，检测灵敏度还比 较低。2、 这些快速技术都是针对总菌进行检测的，对某一种或某一类特定菌的检 测并没有报道，而在实际应用中，人们所需要测量绝大多数为特定的一种或一 类细菌，如大肠杆菌、致病性大肠杆菌等，因为只有知道了细菌的具体种类， 才有可能采取相应的办法进行处理。现在，随着免疫技术的发展，人们也开发 出针对特定菌的快速免疫检测方法，但是，这类方法都需要两个抗体，首先是 一个针对某一种或某一类特定菌的检测抗体，然后是一个用于信号检测的酶标 抗体，比较复杂。
技术实现思路
为了解决现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种检测精度高、可检测 特定微生物、检测灵敏度高的某一种或某一类特定微生物的检测方法。由于本 专利技术所提供的方法不需细胞培养，所以也是一种快速的细菌检测方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案，包括以下步骤a、 捕捉步骤选择对应于特定微生物种类的抗体，通过抗体和特定种类微生物之间的特 异性反应捕捉被测样本中的特定微生物；b、 分离步骤分离捕捉到的特定微生物和被测样本；c、 酶释放步骤向分离后特定微生物的溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，使得所述特定微 生物中的过氧化氢酶释放，进入溶液中；d、 检测步骤向上述溶液中添加过氧化氢，并等待；检测得到过氧化氢酶的浓度，进而得到所述特定微生物的浓度。 作为优选，在所述步骤b中，利用免疫磁珠或免疫层析方法实现分离。作为优选，在所述步骤d中，通过检测过氧化氢浓度的变化，从而得到过 氧化氢酶的浓度。作为优选，利用压力传感器或电化学方法来检测过氧化氢浓度的变化。本专利技术的技术构思是利用免疫反应捕捉特定微生物种类，然后分离特定 微生物(一种或一类)和被测样本；再利用特定微生物自身含有的过氧化氢酶 进行检测，从而避免了 一般免疫检测中需要额外的第二抗体进行标记的弊端。 同时，通过对过氧化氢酶催化底物的检测，充分利用酶的信号放大作用，实施 高灵敏的检测。如图1所示，第一步，通过抗原(特定微生物种类)和抗体(对应于特定 种类微生物)之间的特异性反应，有选择的捕捉被测样本中的特定微生物。由 于抗体和抗原间特异性反应的高度选择性，这样就保证了能够按实际要求检测 特定微生物。在抗原和抗体间特异性反应发生后，由于实际的被测样本中总是会含有各 种各样复杂的成分，而这些不确定的复杂成分可能会对下一步的测量造成干扰， 这也是很多快速检测方法会得到错误信号的原因。为了避免这一问题，本专利技术 方法的第二步是采用分离方法，将被抗体捕捉到的特定微生物细胞和被测样本 分离开来，然后加入特定的检测溶液。这样，在接下来的分析中，除了被捕捉 到的微生物细胞的数量不知道外，其他所有溶剂和溶液都是预知成分的，这样 就大大提高了检测的可靠性。被抗体所捕捉到的微生物细胞和被测样本的具体 分离方法可以采用免疫磁珠方法、也可以采用层析分离的方法，这些方法都有 相关报道。第三步，自然界的微生物可大致分为好氧、厌氧和兼氧三大类。而对食品 安全造成危害的绝大多数是好氧和兼氧菌。所有的好氧菌和兼氧性菌在呼吸的 过程中都会产生过氧化氢，而过氧化氢对细胞有毒害作用。因此，好氧菌和兼 氧性菌自身都含有过氧化氢酶以分解呼吸过程中产生的过氧化氢。本专利技术就是 利用这一事实，将微生物细胞内所含的过氧化氢酶释放出来，通过检测过氧化 氢酶的多少，来推知溶液中特定微生物细胞的浓度。因此，向特定微生物溶液 中加入过氧化氢酶释放试剂，溶液中特定微生物含有的过氧化氢酶释放出。第四步，向特定微生物溶液中加入一定量的过氧化氢，然后检测在过氧化 氢酶的催化作用下， 一定时间后过氧化氢浓度的变化情况。过氧化氢浓度的检 测可以采用电化学检测方法，也可以采用物理的压力检测方法。通过过氧化氢 浓度的变化可得知溶液中过氧化氢酶的浓度，进而得到特定微生物的浓度。与现有技术相比较，本专利技术创造性地将免疫反应、分离技术和酶催化反应 技术结合起来，提出了一种简单、准确的特定微生物的检测方法，具有诸多有 益效果，如1、 利用本专利技术的方法，只需要一种抗体，而不需要免疫检测中常需的酶标 二抗就可以检测特定微生物(一种或一类)，简单方便。通常的检测特定菌的免 疫方法除了检测抗体之外，还需要酶标抗体。酶标抗体中的抗体和酶都是生物 物质，生产保存比较复杂。同时，由于这些方法需要两次抗体/抗原的反应，这 样就加大了整个反应体系的复杂性，容易引起虚假、错误信号。而本专利技术直接 利用被测细胞内的过氧化氢酶来作为"酶标"。这些过氧化氢酶就是被测细胞本 身所带有的， 一旦被测细胞被检测抗体捕捉后就自然存在了，无需第二步的免 疫反应，所以本专利技术大大简化了检测过程，也降低了检测成本，具有很大的优 势。2、 本专利技术中通过磁珠分离或层析分离，方便地排除掉被测样本中可能存在 的各种干扰物质的干扰，提高了检测的精度。在实际样本，特别是环境样本的 检测，样本内包含有各种不可预知的复杂成分。这些样本背景成分很有可能会 对免疫检测带来干扰信号，这也是免疫检测所面临的一大挑战。本专利技术中，在 避免了采用酶标抗体的基础上，进一步提出利用分离方法，特别是磁珠分离技 术和层析分离技术，有选择性的去除被测样本的本底干扰信号，实现免疫检测， 这样对促进本专利技术的适用性具有极大的帮助。3、 本专利技术利用了特定微生物自身所携带的过氧化氢酶，采用过氧化氢为底 物，方便地利用压力法或电化学方法实现过氧化氢酶浓度的检测，大大地简化 了检测装置，提高了检测的灵敏度。过氧化氢是一种重要的化学物质，人们也 已经开发出各种诸如分光光学、化学发光等检测方法。本专利技术中结合所专利技术的方法在较短时间(<30分钟)检测特定种类菌的目的，并考虑到本专利技术方法有在6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特定微生物的检测方法，包括以下步骤：　ａ、捕捉步骤　选择对应于特定微生物种类的抗体，通过抗体和特定种类微生物之间的特异性反应捕捉被测样本中的特定微生物；　ｂ、分离步骤　分离捕捉到的特定微生物和被测样本；　ｃ 、酶释放步骤　向分离后特定微生物的溶液中加入过氧化氢酶释放试剂，使得所述特定微生物中的过氧化氢酶释放，进入溶液中；　ｄ、检测步骤　向上述溶液中添加过氧化氢，并等待；　检测得到过氧化氢酶的浓度，进而得到所述特定微生物的 浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，
申请(专利权)人：聚光科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]