一种人参游离小孢子诱导培养方法技术

本发明专利技术提供了一种人参游离小孢子诱导培养方法，包括下列步骤：（1）花蕾的选择、预处理和灭菌：在人参初花期，采集单核靠边期的花蕾，将花蕾置于4℃低温预处理1~2d后灭菌；（2）小孢子分离与纯化；（3）热激预处理：将小孢子用诱导培养基重新悬浮，分装，将培养皿置于32℃黑暗条件下培养3d；（4）诱导培养：将培养皿转移至25℃黑暗条件下静置培养，当肉眼可见胚状体时，转移至摇床继续培养。本发明专利技术还提供了一种人参游离小孢子诱导培养基，该培养基中通过添加一些特定成分对于人参小孢子的胚胎发生有显著的促进作用。本发明专利技术首次对人参游离小孢子的诱导方法进行探讨，通过诱导培养获得了人参小孢子胚状体，为建立人参游离小孢子培养体系奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种人参游离小孢子诱导培养方法
本专利技术涉及一种人参游离小孢子诱导培养方法，属于药用植物生物

技术介绍
人参（PanaxginsengC.A.Mey）又名黄参、地精、神草等，为五加科人参属植物，其根和地上植株均可入药。人参产于中国、韩国和日本等地，味甘，性温，喜阴凉，具有大补元气、调补五脏，祛除邪气，明目益智、复脉固脱等功效，是“百草之王”，也被称之为“东北三宝”之一。人参含有多种人参皂苷、氨基酸、多肽、多糖人参酶等成分，具有大补元气，补脾益肺，滋补安神，增强记忆力等功效。现代研究发现，人参具有降低氧化应激反应、减缓抑郁、防治老年痴呆、改善动脉粥样硬化、提高成骨细胞存活率、抑制肿瘤细胞生长等方面的药理学作用。随着人们生活水平的提高，人参不仅作为药材使用，在药膳，饮品，保健，化妆品等多个领域都有广泛的应用。人参是我国名贵中药材，在我国具有悠久的栽培历史。在长期的生产实践中，人们积累了丰富的栽培经验，但在育种工作中，因缺乏行之有效的技术手段，至今仍无法打破传统育种的屏障，极大阻碍了人参育种工作的进程。人参属植物虽然类型较多，但变异不稳定，加之它们生长发育缓慢，生长周期长，若没有有效的育种手段，很难在短时间内实现育种新突破。因此，结合物种特性，选用适当的育种方法获得丰富、稳定的遗传类型，加快育种进程是开展人参育种工作的当务之急。单倍体育种是指利用植物组织培养技术（如花药离体培养等）诱导产生单倍体植株，再通过某种手段使染色体组加倍（如用秋水仙素处理），从而选育新品种的育种方法。由于单倍体材料每一种基因都只有一个，加倍后可获得基因型纯合的双单倍体纯合系，能极大地缩短育种周期，从而提高育种效率。花药培养和游离小孢子培养是获得单倍体植株的主要途径，其中游离小孢子培养是近年来在花药培养的基础上发展起来的组织培养技术，与花药培养相比具有更多优势。游离小孢子培养中培养的是已经分离纯净的小孢子，去除了花药壁和绒毡层组织对培养中小孢子细胞分裂、分化、发育的影响。小孢子培养解决了花药培养中常出现的花药体细胞所形成的植株干扰问题，明显的提高了单倍体的再生率。在培养期间，各种外界因素可以直接作用于小孢子，产生的再生植株全部来自于小孢子，由此方法所获得双单倍体植株，在遗传上是高度纯合的。通过小孢子培养获得的纯系，可直接用于培育新品种或作为优良亲本，间接应用于品种改良。同时，小孢子培养技术与转基因技术、常规育种技术结合可以极大提高作物育种水平。游离小孢子培养是在离体培养的条件下改变植物花粉的正常发育方向而形成单倍体植株。在这个过程中，小孢子容易受到各种因素的影响和控制。其中，内因主要包括供体植株的基因型、供体植株的生长环境、小孢子发育时期等，外因主要包括预处理措施、培养基类型、培养基添加物、培养密度、培养条件等。近年来，游离小孢子培养技术有了巨大进步。但由于游离小孢子培养的难度较大、涉及的因素多，尽管我国有较多研究，但大多停留在培养体系建立和初步应用研究上，尚未达到能随意操作小孢子的程度，其应用范围还受植物种、变种和品种的制约。而目前有关人参游离小孢子培养的研究还未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术以不同品种类型的人参为试验材料，系统研究影响其小孢子诱导的因素，建立普遍适用的人参游离小孢子诱导体系，为进一步完善人参小孢子培养技术提供理论依据。本专利技术提供的技术方案如下：一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：包括下列步骤：（1）花蕾的选择、预处理和灭菌：在人参初花期，采集单核靠边期的花蕾，并在显微镜下进一步确定小孢子发育时期；将花蕾保湿并置于4℃冰箱中静置1~2d后灭菌；（2）小孢子分离与纯化：将灭菌后的花蕾用吸水纸沥干水分后放入研钵，加入少量B5-13提取液，用研磨棒轻轻挤压，使小孢子游离到提取液中，经400目尼龙网过滤至10ml离心管，800r/min离心3min，弃上清，沉淀物再加入少量B5-13提取液，摇匀，800r/min离心3min，重复两次；弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子；（3）热激预处理：将纯化后的小孢子用诱导培养基重新悬浮并调整密度，分装入直径60mm的无菌培养皿内，每皿2.5~3.5ml，Parafilm膜封口；将培养皿置于32℃黑暗条件下培养3d；（4）诱导培养：将热激后的培养皿转移至25℃黑暗条件下静置培养，当肉眼可见胚状体时，转移至摇床继续培养。所述步骤（1）中单核靠边期花蕾对应的长度为1.1mm-1.5mm，直径2.1mm-2.8mm，花药颜色为绿色或黄绿色。所述步骤（1）中灭菌的方法为：将人参花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。所述步骤（3）中小孢子密度调整为1.0×105~2.0×105个/ml。所述步骤（3）中诱导培养基的配方如下：Ca（NO3）2·4H2O430-530mg/L，KNO3150-200mg/L，KH2PO4100-150mg/L，MgSO4·7H2O52-76mg/L，NaCl37-45mg/L，FeSO4·7H2O26.4-30.2mg/L，Na2-EDTA35.7-39.3mg/L，H3BO310.6-14.4mg/L，MnSO4·4H2O20.5-24.0mg/L，ZnSO4·7H2O7.7-9.5mg/L，KI0.5-0.6mg/L，Na2MoO4·2H2O0.2-0.3mg/L，CuSO4·5H2O0.05-0.06mg/L，CoCl2·6H2O0.02-0.03mg/L，胆碱1.2-1.6mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，维生素B60.4-0.6mg/L，烟酰胺0.4-0.6mg/L，叶酸0.4-0.6mg/L，生物素0.08-0.10mg/L，L-丝氨酸70-110mg/L，甘氨酸1.0-3.0mg/L，丙酮酸钠15-25mg/L，环腺苷酸35-45mg/L，L-谷胱甘肽20-50mg/L，肌醇60-90mg/L，H2O280-120μmol/L，三十烷醇0.8-1.0mg/L，2,4-D1.4-1.6mg/L，KT0.4-0.6mg/L，褪黑素1.8-2.2mg/L，酵母浸出物400-500mg/L，2-吗啉乙磺酸60-80mg/L，蔗糖120-140g/L，活性炭80-120mg/L。所述步骤（4）中摇床培养的温度为25℃，转速为40~50r/min。所述诱导培养基的pH调节至5.6~6.0，并采用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术首次对人参游离小孢子的诱导培养进行了初步的探索，对预处理、培养条件、培养基等影响人参小孢子出胚率的因素进行了研究，确定了适用于人参游离小孢子培养诱导胚状体的方法，为建立完整、高效的人参游离小孢子培养体系奠定基础。（2）诱导培养基是影响胚状体形成的关键，本专利技术通过大量单因素试验确定了诱导培养基的最佳配方。该培养基中添加了一定浓度的胆碱、烟酰胺、丙酮酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：包括下列步骤：/n（1）花蕾的选择、预处理和灭菌：在人参初花期，采集单核靠边期的花蕾，并在显微镜下进一步确定小孢子发育时期；将花蕾保湿并置于4℃冰箱中静置1~2d后灭菌；/n（2）小孢子分离与纯化：将灭菌后的花蕾用吸水纸沥干水分后放入研钵，加入少量B

【技术特征摘要】
1.一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：包括下列步骤：
（1）花蕾的选择、预处理和灭菌：在人参初花期，采集单核靠边期的花蕾，并在显微镜下进一步确定小孢子发育时期；将花蕾保湿并置于4℃冰箱中静置1~2d后灭菌；
（2）小孢子分离与纯化：将灭菌后的花蕾用吸水纸沥干水分后放入研钵，加入少量B5-13提取液，用研磨棒轻轻挤压，使小孢子游离到提取液中，经400目尼龙网过滤至10ml离心管，800r/min离心3min，弃上清，沉淀物再加入少量B5-13提取液，摇匀，800r/min离心3min，重复两次；弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子；
（3）热激预处理：将纯化后的小孢子用诱导培养基重新悬浮并调整密度，分装入直径60mm的无菌培养皿内，每皿2.5~3.5ml，Parafilm膜封口；将培养皿置于32℃黑暗条件下培养3d；
（4）诱导培养：将热激后的培养皿转移至25℃黑暗条件下静置培养，当肉眼可见胚状体时，转移至摇床继续培养。


2.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中单核靠边期花蕾对应的长度为1.1mm-1.5mm，直径2.1mm-2.8mm，花药颜色为绿色或黄绿色。


3.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中灭菌的方法为：将人参花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。


4.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中小孢子密度调整为1.0×105~2.0×105个/ml。


5.根据权利要求1所述的一种人参游离小孢子诱导培养方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁江，
申请(专利权)人：梁江，
类型：发明
国别省市：吉林;22